铁死亡相关通路与癫痫关系研究进展

罗少翔，何乾超，高玉广

(1.广西中医药大学，广西 南宁 530001；2.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530022)

铁死亡(Ferroptosis)是近年来发现的一种铁依赖性的调节细胞死亡形式，其特征在于细胞内铁离子过载，活性氧自由基(ROS)和脂质过氧化物(LOOH)水平的显著性升高，进而引起细胞膜磷脂内侧发生严重的脂质过氧化反应最终导致膜破裂，细胞崩解死亡[1]。癫痫是神经系统常见的疾病之一，是一种持续存在的能产生癫痫发作的脑部持久性改变，其特点为难治性、反复性和致残性，从而使得癫痫患者在生活、工作、社交等方面由于频繁痫性发作而受到限制，严重影响了患者的生活质量[2]。由于癫痫的基本病理生理学尚未完全了解，因此迫切需要更深入的研究。目前越来越多的证据表明铁死亡在癫痫的发生和发展中起着重要作用，抑制铁死亡很可能是癫痫的有效治疗方法[3]。

1 铁死亡

1.1 铁死亡概述 2003年，Hirschhorn等[4]对小分子进行了筛选，发现了一种小分子可以选择性地杀死被设计为致瘤的人类BJ成纤维细胞，并且其具有杀死含有癌基因RAS的癌细胞的能力，Hirschhorn等将这种化合物命名为“erastin”。在进行典型的细胞凋亡测定时，Hirschhorn等发现erastin可以诱导一种受管制但非凋亡形式的细胞死亡。然而，erastin的杀伤力可以被铁螯合剂和亲脂性抗氧化剂有效抑制。2008年，Yang等[5]发现了另一种化合物，该化合物被命名为RAS选择性致死小分子3(RAS-selective lethal small molecule 3，RSL3)，可诱导类似的非凋亡形式的细胞死亡。2012年，Dixon等[6]进一步研究和归纳上述的细胞死亡形式，提出了一种铁依赖性的程序性细胞死亡概念，并将其正式命名为铁死亡(Ferroptosis)。

1.2 铁死亡机制及其调控

1.2.1 铁离子代谢异常及芬顿反应：细胞中过量的铁离子会促进铁死亡。研究发现的铁离子代谢调节因子包括转铁蛋白(Transferrin,Tf)、转铁蛋白受体-1(Transferrin receptor-1,TfR1)、核受体辅激活蛋白4(Nuclear receptor coactivator 4,NCOA4)等。Tf作为一种能够结合铁离子的血清蛋白，当其在胞外与铁离子结合后，需要通过膜蛋白TfR1才能将铁离子释放到胞内，导致胞内的铁含量升高，进而引起铁死亡的发生。相反的，相关报道称Tf与TfR1的丢失或表达减少能够抑制铁死亡的发生[7-8]。NCOA4是溶酶体降解铁蛋白的过程中必需的运载受体，缺乏NCOA4的细胞无法降解铁蛋白，这使得胞内铁含量减少，从而抑制了铁死亡的发生。反之，过量的NCOA4会结合铁蛋白并将其递送至溶酶体，铁蛋白经溶酶体降解后释放出铁离子，使细胞内铁离子含量过多，进而催化芬顿反应，导致ROS积累，促进铁死亡[9-10]。研究表明，过量的铁离子可以向过氧化氢(H2O2)提供电子产生羟基自由基，也就是芬顿反应。羟基自由基(·OH)是ROS之一，其具有极强的得电子能力，即氧化能力，在自然界中是仅次于氟的氧化剂，羟基自由基及其他活性氧自由基过度的积累，破坏了细胞内的氧化还原环境的动态平衡，并对人体组织和细胞结构造成损害，这种损害称为氧化应激(Oxidative stress,OS)。ROS与生物分子(如蛋白质、脂质和核酸)具有高反应性，能导致脂质过氧化并最终发展为铁死亡[11]。

1.2.2 多不饱和脂肪酸过氧化：多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids,PUFAs)在细胞内膜系统的能量供应和结构成分中起重要作用，并且能够增加膜的流动性；而脂质代谢是许多信号传导过程的关键，包括铁死亡的调节。PUFAs是脂质过氧化的主要底物，细胞中丰富的PUFAs促进脂质过氧化的积累，尤其是在氧化应激条件下与ROS发生脂质过氧化反应明显增加。脂质过氧化物与其最终产物反应性醛，如丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和4-羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal,4-HNE)，对细胞产生有害作用,并且是铁死亡的最有效诱导剂。脂质过氧化物还可以通过酶的酶促反应产生，而这些酶被称为脂氧合酶(Lipoxygenase,LOX)，包括5-脂氧合酶(5-LOX)和12/15-脂氧合酶(12/15-LOX)等，这些酶的活性在Fe2+的辅助下得到增强，并且这些酶优先作用于PUFAs，进而加速脂质过氧化物的积累[12-13]。

1.2.3 GSH/GPX4/系统Xc-合成及作用受限：谷胱甘肽(Reduced glutathione,GSH)是人机体中重要的抗氧化剂，不仅可以清除活性氧自由基，维持胞内活性氧自由基含量的平衡状态，还可以作为谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione peroxidase 4,GPX4)的辅助因子参与脂质过氧化物的还原反应，阻止铁死亡的发生。因此GSH的缺乏可使GPX4失活，还原能力降低，导致脂质过氧化物的积累和铁死亡的发生[14-15]。相关研究发现GPX4是由erastin和RSL3诱导的铁死亡的关键调节因子。GPX4是一种GSH依赖性过氧化物酶，它能够将脂质过氧化物还原为脂质醇。当erastin和RSL3等抑制GPX4活性时，细胞内脂质过氧化物转化为脂质醇的量下降，致使脂质过氧化物过度堆积，从而诱导了铁死亡的发生[16]。同时，另一研究表明GPX4通过调节12/15-LOX的活性来控制脂质的过氧化反应，也就是说，对于抑制能产生脂质过氧化物的LOX，GPX4是必不可少的[17]。胱氨酸/谷氨酸反向转运蛋白是机体细胞膜上由溶质载体家族7成员 11(SLC7A11)和溶质载体家族3成员2(SLC3A2)两个亚基组成的重要抗氧化系统称为系统Xc-(System Xc-)，其主要功能是按1∶1的比例将细胞外的胱氨酸转移至细胞内，并将细胞内的谷氨酸转至细胞外；并且能够将胱氨酸还原为半胱氨酸，参与细胞内重要的自由基清除剂GSH的合成。研究发现erastin及其类似物会抑制System Xc-从而特异性地减少胱氨酸的摄取，由于胱氨酸和半胱氨酸会互相转化，最终导致细胞内半胱氨酸和GSH耗竭及ROS和脂质过氧化水平增加，从而导致铁死亡的发生[18]。

2 铁死亡相关通路与癫痫的关系

2.1 铁代谢通路 铁属于机体代谢所必需的微量元素，它参与了人体多项生理生化过程，随着基础医学发展，因铁代谢紊乱所导致的功能失调和组织病理性改变，受到了越来越多的关注[19]。正常的铁生理水平能促进细胞生长，但是铁代谢的异常变化能影响细胞对细胞死亡的敏感性，包括铁死亡[20]。Chen等[21]研究报道，在氯化铁诱导的创伤后癫痫(PTE)的小鼠模型中，运用一种有效的选择性的铁死亡抑制剂——铁抑素-1(Ferrostatin-1,Fer-1)处理该模型后，发现Fer-1抑制了铁死亡相关指数，如4-HNE和MDA，并且Fer-1在PTE急性期中表现出了抗惊厥作用、保护海马神经元作用、抑制铁中毒作用以及对小鼠无明显不良反应，明显减轻了氯化铁诱导的PTE的发作和相关认知缺陷，证实了铁死亡参与了小鼠PTE的发作过程。Li 等[22]通过在氯化铁诱导的PTE小鼠模型中，发现黄芩素(Baicalein)显著降低癫痫发作评分、发作次数和平均发作时间，并且发现了黄芩素的神经保护作用也在柠檬酸铁铵(FAC)诱导的HT22海马神经元损伤模型中得到验证。此外，在小鼠PTE模型中，发现黄芩素能显著降低铁诱导HT22细胞损伤模型中铁质过氧化指数(ROS、4-HNE等)，抑制12/15-LOX的表达，表明铁死亡受到黄芩素的抑制，进而阻碍了外伤后癫痫的发作，证实了铁死亡参与了小鼠PTE的发作过程。Mao等[23]在戊四唑(PTZ)点燃和毛果芰香碱(Pilo)诱导的癫痫发作的小鼠模型中，观察到癫痫小鼠海马体中铁的大量积累，同时观察到ROS、MDA含量增加和4-HNE水平升高。此外，实验中，用Fer-1治疗后发现，其通过逆转上述效应，也就是通过抑制海马体中的铁积累和降低ROS含量，来减轻小鼠的癫痫发作。证实了铁死亡参与了PTZ点燃和Pilo诱导小鼠的癫痫发作，而Fer-1的运用减轻了PTZ点燃和Pilo诱导的小鼠的癫痫发作。

2.2 脂代谢通路 LOX可启动并直接参与细胞膜的结构和代谢的损伤过程，催化多不饱和脂肪酸氧化为过氧化氢脂肪酸，是铁死亡的重要调节剂。其中15-LOX是中枢神经系统中最丰富的LOX亚型之一，主要分布在基底节和海马的神经元及部分胶质细胞中，所以15-LOX在脂质过氧化引起的神经元铁死亡中起重要作用[24-25]。据相关报道，维生素E的内源性代谢物α-生育酚对苯二酚是一种比其母体化合物更有效的铁死亡抑制剂，其通过将酶的非血红素铁从活性的Fe3+状态还原为不活性的Fe2+状态来抑制15-LOX，进而减少15-LOX主导催化的脂质过氧化反应。因此，在阻止神经元铁死亡中，铁死亡抑制可以由维生素E抑制15-LOX的酶促反应来实现，可以显著减少纹状体细胞的氧化损伤和铁死亡[26]。Zhang 等[27]研究发现，在PTZ点燃的慢性癫痫大鼠模型中，PTZ组15-LOX表达显著升高，GSH和GPX4水平降低，MDA水平升高，提示15-LOX在PTZ点燃的慢性癫痫大鼠脂质过氧化过程中起作用。然而，维生素E预处理组，观察到15-LOX表达受到显著的抑制，铁积累和脂质过氧化水平明显降低，同时大鼠的癫痫发作次数显著减少、神经元兴奋性和神经元细胞死亡均明显下降，表明维生素E通过抑制15-LOX来抑制铁死亡从而减少癫痫发作，证实了铁死亡参与了PTZ点燃的慢性癫痫大鼠的癫痫发作过程。

2.3 GSH/GPX4系统 GPX4是铁死亡过程中重要的调控分子，其主要表达于机体组织生物膜上，能够还原体内过量的ROS，催化机体细胞内的H2O2分解，清除体内的脂质过氧化物[28]。另外，GPX4使用GSH作为辅助因子将脂质过氧化物还原为相应的醇，从而限制了脂质过氧化在膜内的传播[29]。研究报道，拉帕替尼(一种著名的抗癌药物)显著地阻止了海人藻酸(KA)诱导的小鼠的癫痫发作，用拉帕替尼预处理模型小鼠后，参照对照组可观察到，小鼠表现出较低的癫痫发作评分、较短的癫痫发作持续时间、90 min内较少的癫痫发作次数。进一步研究发现，其减少了小鼠海马细胞内GSH水平的降低，同时上调了GPX4的表达，阻止了GPX4依赖性铁死亡的发生，表明铁死亡受到拉帕替尼的抑制，并阻止了模型小鼠癫痫的发作，证实了铁死亡参与了KA诱导的小鼠的癫痫发作过程[30]。另一研究报道，在氯化锂和毛果芸香碱(Licl-Pilo)诱导的颞叶癫痫(TLE)大鼠模型中，运用抗衰老蛋白klotho干预的TLE大鼠海马体，表现出GPX4和GSH水平显著提升，ROS和脂质过氧化水平明显降低，同时大鼠的认知缺陷得到改善，表明klotho通过抑制铁死亡来缓解大鼠的TLE发作及改善伴随的认知缺陷，证实了铁死亡参与了Licl-Pilo诱导的TLE大鼠癫痫发作过程[31]。此外，Ingold 等[32]，通过对缺乏单个硒蛋白的小鼠进行的模型研究，发现小鼠缺乏硒代半胱氨酸相关的GPX4在致命阶段表现出严重的癫痫发作。这表明有一种特殊的中间神经元的存活必须依赖于含硒半胱氨酸的GPX4，从而防止了致命的癫痫发作，也就是说，硒半胱氨酸通过被GPX4的利用，为细胞提供了对不可逆的过氧化精确的抵抗力，因为这种特殊的中间神经元细胞对过氧化物诱导的铁死亡具有高度敏感性。

2.4 下游通路 OS是癫痫生理病理机制的主要因素之一。OS是神经元可塑性改变、神经元死亡、神经退行性改变的重要原因，其能够导致神经元细胞多方面变化，包括蛋白质氧化、DNA氧化和脂质过氧化[33]。研究报道，癫痫发作后在神经细胞中检测到高水平的ROS和OS，并且OS会进一步加重神经元损伤，即在急性脑损伤中，例如癫痫和中风，由于消耗大量氧气，脑组织特别容易受到氧化应激的影响，并且与其他组织相比产生大量的ROS[34]。相关研究[35]证明，在KA诱导的TLE大鼠模型中，海马体中会释放出大量谷氨酸降低GSH水平，GPX4表达降低，抗氧化防御系统被削弱，氧化应激损伤被放大；同时，脂质过氧化物的生物标志物MDA的浓度增加，脂质过氧化物不断产生及积累，这些病理变化是启动和执行铁死亡的关键条件，伴随铁死亡参与TLE大鼠的病理变化过程，TLE大鼠海马神经元出现大量丢失，产生了认知障碍。Qian等[36]研究发现黄芩素在TLE大鼠中产生了优异的抗氧化作用，显著减少了脂质过氧化物水平以及海马体损伤和苔藓纤维萌发，改善了TLE大鼠的认知能力。这些结果表明，黄芩素对大鼠的认知和大鼠海马体的神经保护作用与抑制氧化应激有关，其可以通过减少氧化应激，抑制铁死亡的发生，在治疗颞叶癫痫中发挥显著的神经保护作用。

3 结 语

铁死亡是以铁代谢异常为主导，同时可以通过多种途径及相关因子介导产生过量有害的活性氧自由基，导致细胞氧化还原内环境失衡引发氧化应激，进而使得膜系结构被破坏的一种调节性细胞死亡过程。现有研究表明铁代谢的异常、氧化应激、GPX4/GSH、脂氧合酶等因子介导的铁死亡，与癫痫的发病有着密切的联系，其所涉及的通路和机制处于不断明确中，且铁死亡抑制剂能在一定程度上阻止癫痫的发作及发展；同时铁死亡研究很有可能成为一个新的支点，在癫痫的预防及治疗上发挥至关重要的作用。不足之处：①许多铁死亡抑制剂的运用仍停留在动物实验中，缺少与癫痫相关的临床药用观察；②铁死亡参与癫痫发作过程中，是否与其他的细胞死亡途径相互关联，它们之间的关联对癫痫的发作有何影响，仍然需要更多深入的实验研究与探索；③现今已经发现的各种铁死亡抑制剂中，大多数的作用靶点和潜藏用处仍需更深入的了解，还要更进一步地阐明它们的作用机制、各机制间的联系和作用特点，同时也要研讨联合用药的可能性以及开发特异性更好的抑制剂，这些更深的探索研究及相关工作都将对癫痫的临床治疗产生深远影响。