超声联合血清MYCN、Smad7 mRNA检测对神经母细胞瘤的诊断价值

张 明，蒋兰君，左汴京，霍亚玲

(郑州大学附属儿童医院 河南省儿童医院 郑州儿童医院，河南 郑州 450018)

神经母细胞瘤是一种起源于组织器官的交感神经系统儿童恶性肿瘤，这种恶性肿瘤占所有儿童癌症病例的8%～10%，占全球所有儿童肿瘤死亡病例的15%[1-2]。神经母细胞瘤确诊时年龄小于18个月儿童的预后(即低风险)要好于晚些时候诊断的儿童，而年龄的增长反过来又与较差的预后(即高风险)相关[3]。因此，及早准确诊断神经母细胞瘤可改善儿童预后。超声检查可明确肿瘤内部结构及血流状态等，一般用于寻找起源于腹部的肿瘤，通常作为疑似神经母细胞瘤儿童的首选检查方法之一[4]。MYCN是近几年提出的一种与神经母细胞瘤密切相关的标志物，多项研究报道显示MYCN扩增是衡量神经母细胞瘤治疗效果及预后的生物指标[5-6]。Smad7与胶质母细胞瘤化疗耐药性及上皮间质转化有密切联系[7]。本研究收集48例手术或穿刺病理确诊的神经母细胞瘤患儿，通过分析其超声图像特征及血清MYCN mRNA、Smad7 mRNA检测水平，探讨其联合后在儿童神经母细胞瘤中的临床诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年3月至2022年6月期间于河南省儿童医院确诊的48例神经母细胞瘤患儿为神经母细胞瘤组，患儿年龄1个月至7岁，平均年龄(2.78±1.06)岁，男26例，女22例；同期选取因腹胀、腹泻、便秘、呕吐等原因就诊最终排除神经母细胞瘤的患儿50例作为对照组，患儿年龄2个月至7岁，平均年龄(2.82±1.01)岁，男28例，女22例。病例纳入标准：①神经母细胞瘤患儿经查体、CT等检查，且最终经手术或穿刺病理确诊，符合中国抗癌协会小儿肿瘤专业委员会等编订的《儿童神经母细胞瘤诊疗专家共识》[8]；②患儿临床资料完善，意识清楚，符合研究需要；③入选前未接受放化疗或手术治疗。排除标准：①有神经系统疾病、血液系统疾病或免疫系统疾病者；②有其他严重脏器疾病或肿瘤者；③有先天性心脏病或脏器畸形者。本研究经由河南省儿童医院医学伦理会批准，符合相关标准，入选患儿家长均签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 血清MYCN mRNA、Smad7 mRNA表达水平检测：所有患儿均空腹采血，室温下静置30～60 min，采用离心机以3000 r/min转速离心10 min，提取血清保存备用。采用美国ABI 7300型实时荧光定量PCR(qRT-PCR)仪进行血清MYCN mRNA、Smad7 mRNA水平的检测。根据制造商说明书方法采用RNA提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，货号R1200-100)提取总RNA，反转录试剂盒(上海研谨生物科技有限公司，货号J-SRP1105-100)将其逆转录为cDNA，配置20 μl体积的反应体系，反应条件设置为：95 ℃、5 min；94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，45个循环。采用2-△△Ct法进行目的基因相对表达量计算，MYCN、Smad7及内参GAPDH的引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.2 超声检查：所有患儿均采用荷兰Philips公司生产的Elite三维超声诊断仪检查，探头频率为5～12 MHz的线阵探头及1～5 MHz的凸阵探头。检查前嘱家长使患儿空腹4 h，患儿取仰卧位或侧卧位，常规扫查腹部、肝脏、腹腔淋巴结、双侧肾上腺、盆腔，发现肿瘤后进行多切面检查，主要观察病灶大小、形态、位置、内部回声，是否发生远处脏器转移，与周围血管及脏器的关系，并采用彩色多普勒观察肿瘤内部血流情况。神经母细胞瘤内部血流分级：肿瘤内未见血流信号为0级；肿瘤内少量血流且可见点状血流信号为Ⅰ级；中量血流，一个断面上可见2～4个点状血流信号为Ⅱ级；血流丰富，可见弥漫性交织网状血流显示或4条以上血管为Ⅲ级[9]。

2 结 果

2.1 神经母细胞瘤组和对照组血清MYCN mRNA、Smad7 mRNA表达水平比较 神经母细胞瘤组血清MYCN mRNA、Smad7 mRNA水平显著高于对照组(均P<0.05)，见表2。

表2 神经母细胞瘤组和对照组血清MYCN mRNA、Smad7 mRNA表达水平比较

2.2 血清MYCN mRNA、Smad7 mRNA表达水平对神经母细胞瘤的诊断价值 以血清MYCN mRNA、Smad7 mRNA水平为检验变量，是否为神经母细胞瘤为状态变量绘制ROC曲线，结果显示，血清MYCN mRNA、Smad7 mRNA诊断神经母细胞瘤的曲线下面积(AUC)分别为0.867(95%CI:0.795～0.938)、0.818(95%CI:0.734～0.901)，特异度分别为88.00%、84.00%，灵敏度均为75.00%，临界值分别为1.28、1.18,见图1。

图1 血清MYCN mRNA、Smad7 mRNA表达水平诊断神经母细胞瘤ROC曲线

2.3 超声单独及联合血清MYCN mRNA、Smad7 mRNA对神经母细胞瘤的诊断价值 超声检查结果中假阳性8例，假阴性11例(3例超声误诊为肝母细胞瘤，4例超声误诊为颈部淋巴瘤，4例超声误诊为畸胎瘤)，超声检查与手术或穿刺病理结果比较，诊断符合率为77.08%(37/48)，其一致性较高，Kappa值为0.612(P<0.05)；超声联合血清MYCN mRNA、Smad7 mRNA(采用并联试验进行联合诊断，即任一方法为阳性则判定阳性)检查结果中假阳性9例，假阴性4例，超声检查与手术或穿刺病理结果比较，诊断符合率为91.67%(44/48)，其一致性较高，Kappa值为0.735(P<0.05)。见表3。

表3 超声单独及联合血清MYCN mRNA、Smad7 mRNA对神经母细胞瘤的诊断价值(例)

2.4 超声、血清MYCN mRNA、Smad7 mRNA单独及联合诊断神经母细胞瘤的效能比较 超声联合血清MYCN mRNA、Smad7 mRNA诊断神经母细胞瘤的灵敏度显著高于三者单独诊断(P<0.05)，见表4。

表4 超声、血清MYCN mRNA、Smad7 mRNA单独及联合诊断神经母细胞瘤的效能比较[%(例/n)]

3 讨 论

神经母细胞瘤虽发病率较低，但仍是儿童期最常见的实体瘤，发病年龄中位数为23个月，5岁后确诊病例不到10%[10-11]。神经母细胞瘤在临床上有显著特性，从局部疾病自发消退到积极进展，尽管目前有强化的多模式治疗，但诊断为晚期的儿童预后不佳，5年总生存率约为40%[12]。既往临床诊断神经母细胞瘤主要以手术或穿刺病理结果为主，但其存在患儿耐受差、创伤大的弊端[13]。因此，需要新的辅助诊断方法。

超声是一种公认的周围神经检查方法，它对神经创伤、多发性神经病、单神经炎和神经肿瘤的诊断和治疗规划具有很高的价值，由于其设备的不断改进，超声轴向分辨率现在可以达到30 μm[14]。超声具有成本效益高、易于获取、无辐射等优点，因此也适用于儿童的检查[15]。此外超声在多种癌症的鉴别诊断及治疗中均有重要作用[16-17]。本研究中超声诊断与手术或穿刺病理结果的一致性相对较高，其Kappa值可达0.612，且诊断符合率为77.08%，与刘丽萍等[9]研究结果中的诊断准确率83%相似。

MYCN是Myc基因家族中最具特征的成员之一，主要表达于间质组织和神经系统中，原癌基因MYCN的异常表达是高危神经母细胞瘤的分子标志物，其高表达与患者肿瘤快速增长、化学耐药性及生存率低有关[18-19]。早期研究显示，微小RNA-181c靶向作用于Smad7抑制其表达，可达到抑制神经母细胞瘤的目的[20]。表明Smad7在神经母细胞瘤中发挥癌基因作用。本研究同样显示Smad7在神经母细胞瘤患儿血清中高表达，推测其过度表达可能对激活神经母细胞瘤肿瘤细胞活力有重要作用，进一步促进肿瘤细胞的生长、迁移和侵袭能力，推动肿瘤发生发展。ROC曲线结果显示，血清MYCN mRNA、Smad7 mRNA水平检测可有效诊断神经母细胞瘤，其诊断特异度分别为88.00%、84.00%。当两者临床检测水平高于其截断值1.28、1.18时，诊断为神经母细胞瘤的概率可能更高。此外，超声联合血清指标MYCN mRNA、Smad7 mRNA后诊断神经母细胞瘤的灵敏度显著增加。进一步提示超声联合血清指标可通过多方面综合诊断，进而使诊断效能得到提高，为神经母细胞瘤的早期诊断提供了新的思路及临床指导。

综上，超声与血清MYCN mRNA、Smad7 mRNA联合检测对儿童神经母细胞瘤有较高的诊断价值，其灵敏度较三者单独诊断显著提高，一定程度弥补了超声诊断神经母细胞瘤时因影像学特征不典型而导致的漏诊。