类叶升麻苷调控miR-496表达对高糖诱导小鼠肾脏足细胞损伤的影响

王丽 卢发菊 李薇 马明福

糖尿病肾病(DN)是糖尿病最为严重的微血管并发症之一，是终末期肾脏疾病的主要原因。近年来，DN发病率急剧上升，已成为严重的全球公共卫生问题[1]。最近研究表明，在高血糖刺激下足细胞损伤并导致肾小球滤过率下降和持续性蛋白尿，是DN早期发生的关键因素[2]。因此，减轻高糖诱导的足细胞损伤可能对DN防治具有重要价值。类叶升麻苷又叫麦角甾苷，是一种重要的、在多种植物中分布的天然产物，具有抗炎、抗氧化、神经保护、抗肿瘤等生物活性。研究显示，类叶升麻苷对PC12细胞缺糖缺氧损伤具有保护作用[3]。此外，类叶升麻苷可以通过调节TH22淋巴细胞的趋化性和增殖来减轻系膜细胞炎性损伤，改善尿蛋白排泄[4]。然而，笔者发现类叶升麻苷对高糖诱导的足细胞损伤是否具有保护作用鲜有报道。近年来，微小RNA(miRNA)作为天然的存在的非编码调节分子受到越来越多的关注，且多种miRNA通过调节足细胞的丢失和功能障碍在DN进展中发挥作用[5,6]。现有研究显示，miR-496在2型糖尿病患者外周血单核细胞中表达下调，过表达miR-496可减轻缺氧复氧诱导的心肌细胞损伤[7,8]。本研究通过观察类叶升麻苷对高糖诱导的足细胞损伤以及miR-496表达的影响，探讨其潜在分子机制，以期为类叶升麻苷用于防治DN提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 小鼠肾脏足细胞(MPC5)购自上海通派生物科技公司；γ干扰素购自美国Sigma公司；RPMI-1640培养基、胎牛血清购自美国Invitrogen公司；类叶升麻苷(纯度≥98%)购自上海源叶生物科技有限公司；miR-496模拟物(miR-496 mimics)、模拟物阴性对照(miR-NC)、miR-496抑制物(anti-miR-496)、抑制物阴性对照购(anti-miR-NC)自上海吉凯基因化学技术有限公司；膜联蛋白V异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡检测试剂盒购于上海凯基生物；兔源肾病蛋白(nephrin)单克隆抗体、兔源足突蛋白(podocin)单克隆抗体、兔源Bcl-2单克隆抗体、兔源Bax单克隆抗体、兔源GAPDH多克隆抗体以及山羊抗兔IgG二抗购于美国Abcam公司；miRNA逆转录试剂盒、SYBR Green Mix购于北京天根生化科技公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:参照黎妮等[9]方法采用RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清和γ干扰素)于33℃、含5%CO2的培养箱中培养MPC5细胞。细胞80%融合时进行传代，更换为含5%胎牛血清、不含γ干扰素的培养基于37℃、含5%CO2的培养箱培养14 d使其分化成熟。实验前用不含γ干扰素的培养基同步化培养24 h后备用。

1.2.2 实验分组:取生长状态良好的MPC5细胞接种6孔板，按照实验分组进行如下处理。①正常糖(NG)组：补充5 mmol/L葡萄糖；高糖(HG)组：补充30 mmol/L葡萄糖；高糖+类叶升麻苷-低剂量(HG+AS-L)组：补充30 mmol/L葡萄糖和1.0 μmol/L类叶升麻苷；高糖+类叶升麻苷-中剂量(HG+AS-M)组：补充30 mmol/L葡萄糖和10.0 μmol/L类叶升麻苷；高糖+类叶升麻苷-高剂量(HG+AS-H)组：补充30 mmol/L葡萄糖和100.0 μmol/L类叶升麻苷。各组孵育48 h后，分别检测细胞凋亡、nephrin和podocin蛋白表达以及miR-496表达情况。②为证实类叶升麻苷对高糖诱导的足细胞损伤的保护作用与调控miR-496表达有关，将MPC5细胞分为HG+miR-NC组、HG+miR-496组、HG+AS+anti-miR-NC组、HG+AS+ anti-miR-496组。HG+miR-NC组、HG+miR-496组为利用LipofectamineTM 2000将miR-NC、miR-496分别转染60%融合的MPC5细胞，转染48 h后，用补充30 mmol/L葡萄糖的培养液孵育细胞48 h。HG+AS+anti-miR-NC组、HG+AS+anti-miR-496组为将anti-miR-NC、anti-miR-496分别转染MPC5细胞，转染48 h后，用补充30 mmol/L葡萄糖和100.0 μmol/L类叶升麻苷的培养液孵育细胞48 h。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡:用胰蛋白酶处理各组贴壁细胞获得单细胞悬液。用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤并离心去除上清液后，加入195 μl结合溶液轻柔重悬细胞。然后，加入5 μl的Annexin V-FITC轻轻混匀，然后加入10 μl的PI染色液。在20℃下暗室中孵育30 min，流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.4 蛋白质印记(Western blot)检测nephrin、podocin、Bcl-2和Bax蛋白表达:加入细胞裂解液冰上裂解细胞，获得细胞总蛋白，定量后煮沸3 min使其变性。取30 μg总蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，随后利用湿法转膜仪将蛋白转移至聚偏氟乙烯膜。在封闭和洗涤后，将膜与一抗溶液(nephrin为1∶5 000，podocin、Bcl-2和Bax为1∶2 000)在37℃下孵育45 min。充分洗涤后，膜与二抗在37℃孵育45 min。再次洗膜后，用增强化学发光显色液暗室显影。凝胶成像系统分析各条带灰度值，以目的蛋白和内参GAPDH灰度值比值表示目的蛋白相对表达量。

1.2.5 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-496表达:Trizol试剂提取各组细胞的总RNA。提取后，利用miRNA逆转录试剂盒将miRNA样品逆转录为cDNA。使用SYBR Green Mix通过RT-qPCR扩增cDNA模板。U6作为miR-496的内部对照，2-ΔΔCt法分析miR-496相对表达量。miR-496上游引物5’-GCCGAGTGAGTATT ACATGGCC-3’，miR-496下游引物5’-TGAGTATTACATGGCCAATCTC-3’；U6上游引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，U6下游引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

2 结果

2.1 类叶升麻苷对高糖诱导的小鼠足细胞中nephrin和podocin蛋白表达的影响 与NG组比较，HG组MPC5细胞中nephrin和podocin蛋白表达显著降低(P<0.05)；与HG组比较，HG+AS-L、HG+AS-M、HG+AS-H组MPC5细胞中nephrin和podocin蛋白表达显著升高(P<0.05)，且HG+AS-L、HG+AS-M、HG+AS-H3组间nephrin和podocin蛋白表达比较有统计学意义(P<0.05)。见表1，图1。

图1 nephrin和podocin蛋白表达

表1 类叶升麻苷对高糖诱导的小鼠足细胞中nephrin和podocin蛋白表达的影响

2.2 类叶升麻苷对高糖诱导的小鼠足细胞凋亡的影响 与NG组比较，HG组MPC5细胞凋亡率、Bax蛋白表达显著升高，Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.05)；与HG组比较，HG+AS-L、HG+AS-M、HG+AS-H组MPC5细胞凋亡率、Bax蛋白表达显著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达显著升高，且HG+AS-L、HG+AS-M、HG+AS-H3组间上述指标比较均有统计学意义(P<0.05)。见图2，表2。

图2 类叶升麻苷高糖诱导的小鼠足细胞凋亡的影响；A 凋亡相关蛋白表达；B 细胞凋亡流式图

表2 类叶升麻苷对高糖诱导的小鼠足细胞凋亡的影响

2.3 类叶升麻苷对高糖诱导的小鼠足细胞中miR-496表达的影响 与NG组比较，HG组MPC5细胞miR-496表达显著降低(P<0.05)；与HG组比较，HG+AS-L、HG+AS-M、HG+AS-H组MPC5细胞miR-496表达显著升高(P<0.05)，且HG+AS-L、HG+AS-M、HG+AS-H3组间miR-496表达比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 类叶升麻苷对高糖诱导的小鼠足细胞中miR-496表达的影响

2.4 上调miR-496对高糖诱导的小鼠足细胞中nephrin和podocin蛋白表达的影响 与HG+miR-NC组比较，HG+miR-496组MPC5细胞miR-496表达显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)，nephrin和podocin蛋白表达显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4，图3。

表4 上调miR-496对高糖诱导的小鼠足细胞中nephrin和podocin蛋白表达的影响

图3 nephrin和podocin蛋白表达

2.5 上调miR-496对高糖诱导小鼠足细胞凋亡的影响 与HG+miR-NC组比较，HG+miR-496组MPC5细胞凋亡率、Bax蛋白表达显著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达显著升高(P<0.05)。见图4，表5。

图4 上调miR-496对高糖诱导的小鼠足细胞凋亡的影响；A 凋亡相关蛋白表达；B 细胞凋亡流式图

表5 上调miR-496对高糖诱导的小鼠足细胞凋亡的影响

2.6 下调miR-496表达逆转了100 μmol/L类叶升麻苷高糖诱导小鼠足细胞损伤作用 与HG+AS+anti-miR-NC组比较，HG+AS+anti-miR-496组MPC5细胞miR-496表达显著降低，nephrin、podocin和Bcl-2蛋白表达显著降低，细胞凋亡率和Bax蛋白表达显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图5，表6。

图5 下调miR-496逆转了类叶升麻苷高糖诱导的小鼠足细胞损伤的作用；A nephrin、podocin和凋亡相关蛋白表达；B 细胞凋亡流式图

表6 下调miR-496逆转了类叶升麻苷高糖诱导的小鼠足细胞损伤的作用

3 讨论

已有的研究显示，类叶升麻苷主要存在于地黄属、肉苁蓉属和连翘属等植物中，除具有抗衰老、免疫增强、保肝、增强记忆力等作用外，在慢性肾炎、IgA肾病等泌尿系统疾病中具有保护作用[10,11]。然而，类叶升麻苷对高糖诱导的足细胞损伤是否具有保护作用仍有待证实。

nephrin和podocin是足细胞狭缝隔膜上的主要结构成分，其紧密作用于足突的外膜，调节足细胞与基底膜之间的关系，在维持肾滤过屏障的完整性中起着重要作用[12]。上调podocin和nephrin蛋白可减少DN大鼠尿蛋白排泄率，缓解DN进展[13]。本研究发现高糖诱导后MPC5细胞nephrin和podocin蛋白表达显著降低，而类叶升麻苷处理呈剂量依赖效应提高高糖诱导的MPC5细胞中nephrin和podocin蛋白表达水平。与本研究结论类似，丁方睿等[14]证实类叶升麻苷通过恢复足细胞标记物nephrin表达，保护足细胞骨架，进而缓解嘌呤霉素诱导的足细胞损伤。细胞凋亡是DN早期足细胞病理性丢失的重要原因。Bax和Bcl-2是参与细胞凋亡的两个关键蛋白，其在包括在足细胞内多种细胞凋亡中发挥重要作用[15]。本研究显示高糖诱导后MPC5细胞凋亡率、促凋亡蛋白Bax表达显著升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著降低，而类叶升麻苷处理呈剂量依赖效应减轻高糖对MPC5的促凋亡作用。以上研究说明，类叶升麻苷处理对高糖诱导的足细胞损伤具有保护作用。

近年来，越来越多研究证实miRNA在调节足细胞的生理和病理发生中的潜在作用。Wu等[16]指出在嘌呤霉素氨基核苷处理的大鼠中，miR-30的缺失可诱导蛋白尿和足细胞损伤。Zhang等[17]发现下调miR-770-5p表达可抑制高糖诱导的足细胞凋亡和炎性反应。本研究发现高糖诱导的MPC5细胞中miR-496表达下调，通过转染外源性miR-496 mimics上调miR-496表达能够减轻高糖诱导的MPC5细胞凋亡，并提高nephrin和podocin蛋白的表达水平，提示上调miR-496表达对高糖诱导的MPC5细胞损伤具有保护作用。与本研究结论类似，Yao等[18]证实上调miR-496还可降低脑缺血/再灌注损伤。类叶升麻苷处理后，高糖诱导的MPC5细胞中miR-496的表达水平呈剂量依赖性显著升高，提示类叶升麻苷对高糖诱导的MPC5细胞的保护作用可能与上调miR-496表达有关。进一步研究发现，下调miR-496表达能够逆转类叶升麻苷对高糖对诱导的MPC5细胞凋亡、nephrin和podocin蛋白、凋亡相关蛋白表达的影响，这进一步说明类叶升麻苷通过上调miR-496表达对高糖对诱导的MPC5细胞损伤具有保护作用。

总之，本研究证实类叶升麻苷对高糖诱导的小鼠足细胞损伤具有保护作用，其机制与上调miR-496表达有关，这为类叶升麻苷用于防治DN奠定了实验基础。