hsa_circ_0000734吸附miR-16-5p抑制类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的生长和迁移

彭子辉 王解 张正森 李晶晶

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是最常见的慢性自身免疫性疾病，其特征是滑膜组织炎症、关节软骨破坏和关节畸形，其确切原因尚不完全清楚[1]。滑膜成纤维细胞在软骨破坏中起重要作用，越来越多的证据表明，活化的滑膜成纤维细胞可以表现出与肿瘤样细胞相似的特性，例如过度增殖和迁移以及凋亡不足[2,3]。滑膜成纤维细胞不受控制的生长和迁移被认为是RA形成的原因[4]。因此，有效抑制滑膜成纤维细胞的增殖和迁移并促进细胞凋亡有助于RA症状的改善。环状RNA(circRNA)是一类新近鉴定的非编码RNA分子，其特征是没有自由5’端帽子或3’poly(A)尾部的非规范反向剪接。在过去的十年中，高通量测序与生物信息学分析相结合的发展导致circRNA研究的极速增长[5]。尽管大多数circRNA的生物学功能仍然未知，但逐渐明确的是，circRNA充当竞争性内源RNA(ceRNA)与miRNA结合在人类疾病中具有调控功能[6,7]。以往研究显示，在RA患者的外周血单个核细胞中hsa_circ_0000734的表达明显降低[8]。然而，hsa_circ_0000734在RA中的作用尚不清楚。因此，本研究旨在确定hsa_circ_0000734对RA滑膜成纤维细胞生长和迁移的影响及潜在机制，以期为RA的治疗提供新的方向。

1 材料与方法

1.1 实验细胞 RA滑膜成纤维细胞系MH7A(美国ATCC)。

1.2 主要试剂与仪器 RPMI 1640培养基和胎牛血清(美国Gibco公司，批号：10567014、10099141)；Lipofectamine 3000转染试剂(赛默飞世尔，批号：20200216)；hsa_circ_0000734过表达质粒和pcDNA3.1空载体质粒、miR-16-5p mimics和mimics control(上海吉玛)；Transwell小室(美国Corning，批号：356234)；CCK-8试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(碧云天研究所，批号：C0037、P0012A)；RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒和实时荧光定量PCR试剂盒(北京索莱宝，批号：20191203、20200422)；AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(日本TaKaRa，批号：RR526A)；PCNA、Cleaved Caspase-3、MMP-2和MMP-9兔抗单克隆抗体(美国CST公司，批号：34452、12655、40994、13667)；山羊抗兔二抗(美国Abcam，批号：ab1670)；双荧光素酶报告系统检测试剂盒(上海翊圣生物科技，批号：20191012)；BCA蛋白定量检测试剂盒和ECL化学发光检测试剂盒(赛默飞世尔，批号：20191208、20180519)；HF160W型二氧化碳培养箱(上海力申科学仪器)；FR-200A凝胶分析系统(上海普诺森生物)；CFX96 Touch型实时荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad)。

1.3 细胞培养、转染与分组 MH7A细胞采用RPMI 1640培养基(含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和链霉素双抗)进行培养，将细胞放置在常规培养箱中，培养条件设为5%CO2、37℃、饱和湿度。对数期的MH7A细胞接种到6孔板中，过夜培养，待细胞生长密度达60%左右时进行转染，具体转染步骤严格参照Lipofectamine 3000转染试剂说明书，将转染hsa_circ_0000734过表达质粒的MH7A细胞命名为hsa_circ_0000734组，转染pcDNA3.1空载体质粒的MH7A细胞命名为NC组，未行转染处理的MH7A细胞命名为Mock组。转染48 h后收集各组MH7A细胞，进行相关指标检测。

1.4 qRT-PCR检测hsa_circ_0000734和miR-16-5p的表达 使用RNA提取试剂盒提取转染48 h后各组MH7A细胞中的RNA，以RNA为模板，使用逆转录试剂盒合成cDNA，使用实时荧光定量PCR检测试剂盒，以cDNA为模板行PCR检测。以GAPDH作为内参，检测hsa_circ_0000734的相对表达水平，以U6作为内参，检测miR-16-5p的相对表达水平。以2-ΔΔCt法计算hsa_circ_0000734和miR-16-5p的表达水平。QRT-PCR引物序列如下：hsa_circ_0000734 F 5’-CAGCTGAAGCAGTTGGAGTG-3’；R 5’-GATAACGCGGCGGACTATT-3’。GAPDH F 5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’；R 5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。miR-16-5p F 5’-TAGCAGCACGTAAATATTGGCG-3’；R 5’-TGCGTGTCGTGGAGGAGTC-3’。U6 F 5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；R 5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.5 CCK-8法检测细胞增殖活力 分组处理48 h后各组MH7A细胞接种至96孔板中，每组设3个复孔，另设只含培养液不含细胞的调零孔，于37℃培养箱过夜培养，除去培养液，向每孔细胞中加入CCK-8溶液10 μl，孵育2 h，使用酶标仪测定细胞的吸光度(A)值，波长设为490 nm，计算细胞存活率，细胞存活率(%)=[(实验孔A值-调零孔A值)/(对照孔A值-调零孔A值)]×100%。

1.6 Annexin V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡水平 MH7A细胞转染48 h后，以胰酶消化收集细胞6×105个细胞，使用预冷的PBS洗涤细胞3次，加入200 μl结合缓冲液重悬细胞，取100 μl细胞悬液，添加5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI染液，混匀，避光反应15 min，添加400 μl细胞悬液，上流式细胞仪检测细胞凋亡情况，采用Cell Quest软件分析各组MH7A细胞凋亡率。

1.7 Transwell检测 各组MH7A细胞转染48 h后，加入胰酶进行消化，收集并计数约5×104个细胞，使用200 μl不含血清的培养液重悬细胞，将细胞悬液加到Transwell小室的上室，并于下室添加500 μl含10%胎牛血清的培养液，放置在5%CO2、37℃培养箱，继续孵育24 h。PBS洗涤3次，添加4%多聚甲醛固定30 min，用棉签擦去未穿膜的细胞，结晶紫染色，洗涤后晾干，显微镜观察并统计穿过基底膜的细胞数，以穿膜细胞数的多少反映细胞迁移能力的大小。

1.8 Western blot检测 转染48 h后各组MH7A细胞采用RIPA裂解液裂解，抽提总蛋白，以BCA法测定蛋白浓度，将蛋白与上样缓冲液混合，沸水浴致蛋白变性，取30 μg蛋白行SDS-PAGE电泳，电泳结束后转移到PVDF膜上，随后在封闭液中封阻2 h。洗膜后加入相应稀释的单抗(PCNA 1∶800稀释，Cleaved Caspase-3、MMP-2和MMP-9 1∶500稀释)，4℃孵育15 h，洗膜，再加入二抗(1∶3 000稀释)，孵育2 h，采用ECL显色液，采用凝胶成像系统获取图像，GAPDH标定，以Imag J软件分析各条带灰度值，计算PCNA、Cleaved Caspase-3、MMP-2和MMP-9的相对表达水平。

1.9 双荧光素酶报告基因实验 根据生物信息学预测结果，扩增miR-16-5p结合位点的hsa_circ_0000734野生型(hsa_circ_0000734-Wt)和突变型(hsa_circ_0000734-Mut)荧光素酶报告载体，使用Lipofectamine 3000转染试剂将重组载体质粒分别与miR-16-5p mimics或mimics control共转染MH7A细胞，继续培养48 h，分别收集各组细胞，使用双荧光素酶报告系统检测分析海肾荧光素酶活性和萤火虫荧光素酶活性，计算MH7A细胞的相对荧光素酶活性。

2 结果

2.1 hsa_circ_0000734和miR-16-5p在3组MH7A细胞中的表达 与Mock组和NC组比较，hsa_circ_0000734组细胞中hsa_circ_0000734的表达水平明显升高(P<0.05)，miR-16-5p的表达水平明显降低(P<0.05)；Mock组和NC组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 hsa_circ_0000734和miR-16-5p在3组细胞中的表达水平比较

2.2 过表达hsa_circ_0000734对MH7A细胞增殖能力的影响 与Mock组和NC组比较，hsa_circ_0000734组细胞增殖活力和PCNA的表达水平均明显降低(P<0.05)；Mock组和NC组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见图1，表2。

图1 Western blot检测PCNA的表达水平

表2 3组MH7A细胞增殖活力和PCNA表达水平比较

2.3 过表达hsa_circ_0000734对MH7A细胞凋亡的影响 与Mock组和NC组比较，hsa_circ_0000734组细胞凋亡率和Cleaved Caspase-3的表达水平均明显升高(P<0.05)；Mock组和NC组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3，图2。

表3 3组MH7A细胞凋亡率和Cleaved Caspase-3表达水平比较

图2 过表达hsa_circ_0000734对MH7A细胞凋亡的影响；A Western blot检测Cleaved Caspase-3的表达；B AnnexinV-FITC/PI双染色法检测MH7A细胞凋亡率

2.4 过表达hsa_circ_0000734对MH7A细胞迁移能力的影响 与Mock组和NC组比较，hsa_circ_0000734组迁移细胞数明显减少，MMP-2和MMP-9的表达水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)；Mock组和NC组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表4，图3。

表4 3组迁移细胞数、MMP-2和MMP-9表达水平比较

图3 过表达hsa_circ_0000734对MH7A细胞迁移能力的影响；A Western blot检测各组MH7A细胞中MMP-2和MMP-9的表达；B Transwell迁移实验检测3组MH7A细胞迁移能力(结晶紫染色×100)

2.5 hsa_circ_0000734和miR-16-5p靶向关系验证 生物信息学和双荧光素酶报告基因实验分析hsa_circ_0000734和miR-16-5p的靶向结合关系，在线数据库Starbase预测发现，hsa_circ_0000734和miR-16-5p之间存在特异性结合位点。随后双荧光素酶报告基因实验结果显示，与miR-NC组比较，miR-16-5p组hsa_circ_0000734-Wt细胞的相对荧光素酶活性明显降低(P<0.05)，而hsa_circ_0000734-Mut细胞的相对荧光素酶活性变化差异无统计学意义(P>0.05)。见图4，表5。

图4 Starbase预测hsa_circ_0000734和miR-16-5p结合位点示意图

表5 3组MH7A细胞的相对荧光素酶活性比较

2.6 过表达miR-16-5p对MH7A细胞增殖、凋亡和迁移能力的影响 采用共转染同时过表达miR-16-5p和hsa_circ_0000734，与hsa_circ_0000734组比较，miR-16-5p+hsa_circ_0000734组MH7A细胞中miR-16-5p的表达和细胞增殖活力明显升高，迁移细胞数明显增加，细胞凋亡率明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表6。

表6 2组细胞miR-16-5p的表达、增殖活力、凋亡和迁移能力比较

3 讨论

RA是一种病因不明的全身性自身免疫性疾病，其可导致关节损伤、残疾。以往研究表明，位于滑膜内膜边缘的成纤维样滑膜细胞在RA的病理生理过程中起关键作用[9]。据报道，滑膜成纤维细胞与肿瘤细胞具有相似的特性，例如，它们可以经历肿瘤样增殖、侵袭、迁移和抗凋亡[10]。滑膜成纤维细胞可以迁移到未受影响的关节，附着在软骨和骨上，并侵入细胞外基质。因此，滑膜成纤维细胞无疑是关节炎破坏向远关节扩散的重要因素[11]。抑制滑膜成纤维细胞的增殖和迁移能够抑制RA的发展。MH7A是滑膜成纤维细胞的一种，常用于RA发病机制的研究[12,13]。因此，本研究选择了MH7A细胞作为材料。

在过去的几十年里，人们对RA的分子机制进行了大量的探索，然而，以往的研究大多集中在编码蛋白质的基因上。近年来的证据表明，尽管非编码RNA不直接编码蛋白质，但它们在蛋白质编码基因的转录和翻译中起着调节作用[14,15]。越来越多的证据表明，circRNA广泛参与各种生理和病理过程，包括许多疾病的发生和发展，包括肿瘤和自身免疫性疾病等[16]。circRNA是真核生物中丰富的保守内源生物分子，具有组织特异性和细胞特异性表达模式。环状RNA水平的调节可导致多种分子和生理变异，研究人员在RA方面开展了一些工作，例如识别新的生物标志物或探索特定circRNA的功能[17]。然而，关于RA中circRNA的机制的细节仍不清楚。最近的一些研究表明，外周血单个核细胞中的hsa_circ_0001200、hsa_circ_0001566、hsa_circ_0003972和hsa_circ_0008360等参与了RA的发病机制，可以通过微阵列分析作为RA的潜在生物标志物，并且hsa_circ_0000734的表达明显下调[8]。然而，hsa_circ_0000734在RA中的作用尚不清楚。本研究发现，过表达hsa_circ_0000734能够明显抑制MH7A细胞增殖活力和迁移细胞数，并且提高细胞凋亡率。此外，过表达hsa_circ_0000734的MH7A细胞中与增殖相关蛋白PCNA的表达明显降低，与凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3的表达明显升高。同时，滑膜成纤维细胞还可以自发分泌大量基质金属蛋白酶(包括MMP-2和MMP-9)，在关节软骨的进行性破坏中发挥重要作用[18]。本实验结果显示，过表达hsa_circ_0000734的MH7A细胞中MMP-2和MMP-9的表达明显降低。以上结果提示，过表达hsa_circ_0000734能够有效抑制MH7A细胞的增殖和迁移，并诱导细胞凋亡。

众所周知，circRNA通过多种机制发挥重要的生物学作用，包括染色质修饰、剪接等。此外，越来越多的证据表明，circRNA可能通过共表达网络在RA中发挥重要的调控作用[19]。越来越多的证据表明，miRNA在RA发病机制中起重要作用[20]。例如，miR-152通过靶向ADAM10抑制RA滑膜成纤维细胞增殖并诱导细胞凋亡[21]。miR-338-5p通过靶向ADAMTS-9抑制RA滑膜成纤维细胞增殖和侵袭[22]。RA患者血清miR-16-5p水平高于健康对照组，提示miR-16-5p不仅可以作为RA的生物标志物，而且可以为RA的病理生理学研究提供更多的线索[23]。本实验前期通过生物信息学预测发现，hsa_circ_0000734和miR-16-5p存在靶向结合位点，提示二者可能存在靶向关系，后续实验证实hsa_circ_0000734能够靶向调控miR-16-5p的表达。因此，本研究构建了一个circRNA-miRNA调控网络来探究circRNA在RA中的作用机制。本实验结果还发现，miR-16-5p模拟物可以拯救hsa_circ_0000734的促进功能。从机制上讲，hsa_circ_0000734通过充当miR-16-5p的海绵来促进滑膜成纤维细胞的增殖和迁移。这些结果表明，hsa_circ_0000734可能是RA进程中的关键circRNA。