小麦灌浆期耐高温性状QTL定位与分析

刘秀坤，王克森，翟胜男，张华锋，单宝雪，肖延军，李豪圣，刘建军，张玉梅，孟福燕，曹新有，赵振东

(1. 青岛农业大学农学院，山东 青岛 266109；2. 山东省农业科学院作物研究所/小麦玉米国家工程中心/农业部黄淮北部小麦生物学与遗传育种重点实验室/山东省小麦技术创新中心，山东 济南 250100；3. 陵县友合种业有限公司，山东 德州 253500；4. 郓城县种子公司，山东 郓城 274700)

小麦是世界上的主要口粮作物之一，也是我国第二大粮食作物[1]，是全球35%～40%人口的主食。2019年初，世界气象组织(WMO)发布了2018年全球平均气温数据，相较于1980—2010年的平均值上升了0.38℃，亚欧大陆的地表平均气温较2017年上升了0.58℃[2]。在全球变暖趋势下，未来我国高温天气可能将趋于常态化。小麦是喜凉的C3作物，日均温20～24℃有利于其籽粒灌浆[3－5]。而我国黄淮冬麦区小麦扬花后常出现30℃以上的高温天气，再加上低湿及一定风力的影响，常表现出较严重的干热风危害，成为限制小麦产量和品质提高的重要环境因素之一[5，6]。因此，定位耐高温相关性状QTL，开发与耐高温特性关联位点紧密连锁的分子标记，对小麦耐高温遗传特性研究具有重要的理论意义。

旗叶是小麦重要的感光部位，在开花后期和籽粒灌浆阶段发生高温胁迫时，叶片衰老速率显著增强[3]。小麦旗叶干尖指数是描述叶片持绿性的重要指标[7]，能直观地反映植株生长发育后期的耐高温特性，可以作为小麦叶片持绿性和耐高温特性的鉴定指标[8]。千粒重作为产量三要素之一，直接影响小麦产量。灌浆期高温胁迫会导致灌浆速率下降，缩短籽粒成熟期，致使千粒重降低[9，10]。同时，高温胁迫会使小麦淀粉含量下降，降低直链淀粉含量，影响面团强度，进而对面粉的加工品质造成影响[11，12]。

小麦耐高温相关性状属于多基因控制的数量遗传性状，易受环境影响。评价指标、目标性状、生育时期、高温处理方法和时间等因素都会影响品种的耐高温特性评价结果[13]。学者们在对小麦耐高温特性研究的过程中，选用的鉴定方法和评价指标有所差异，所得到的结果也不尽相同。陈希勇等[14]以中国春－HOPE 染色体代换系为试验材料，通过细胞膜热稳定性和大田生产条件下高温胁迫处理的方法，将耐高温QTLs 定位在2A、2B、3A、3B、4B 染色体上。Pinto 等[15]以“Seri/Babax”重组自交系为研究对象，高温胁迫下冠层温度为鉴定指标，将耐高温QTL 定位在1B、2B、3B、4A、4B 和7A 染色体上。Mason 等[16]利用RIL 群体，定位到多个千粒重热感指数QTLs，分布于1B、5A 和6D 染色体上。

为加快耐热育种的进程，定位更多的耐热相关主效QTL，将为小麦耐热机理解析提供支撑。本研究以耐高温的菏麦13 和对高温敏感的临麦2 号构建的F8代RIL 群体为试验材料，通过大田人工模拟高温胁迫试验，以旗叶干尖指数和千粒重热感指数作为鉴定指标综合衡量小麦耐高温特性，通过SNP 芯片进行连锁分析，定位与高温胁迫相关的QTLs，以期为挖掘响应高温胁迫的基因及小麦耐高温胁迫遗传改良奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以耐高温品种菏麦13 为母本、感高温品种临麦2 号为父本，杂交F1代后自交得到F2代，通过单籽粒传法直至自交得到200 个株系的F8代RIL群体。

1.2 大田试验设计与研究方法

1.2.1 试验设计与处理方法 RIL 群体及其亲本分别于2017年和2018年10月上旬种植于山东省济南市试验基地，2018年10月中旬种植于山东省德州市陵城区试验基地。采用随机区组设计，3 次重复，3 行区种植，行长2 m，行距0.25 m，每行均匀点播50 粒种子；每一重复加耐高温(菏麦13)和高温敏感(临麦2 号)对照。田间管理与大田试验一致。

试验设置高温胁迫和正常条件2 种处理。高温胁迫处理是在小麦扬花后14 天进行人工扣棚增温，白天扣棚，晚间移除；正常条件即不扣棚，保持自然环境下生长。棚内外挂温度计，记录棚内外温度。

1.2.2 调查性状 (1)旗叶干尖指数:指旗叶干尖面积占旗叶总叶面积的比例。共分为4 个等级:Ⅰ(0 ～ 10%)、Ⅱ(20% ～ 50%)、Ⅲ(60% ～80%)、Ⅳ(90%～100%)。随等级升高，株系对高温胁迫的敏感度增强。从扬花第14 天进行人工扣棚高温处理，处理第7 天调查旗叶干尖指数，以株系材料种植区50%以上旗叶所处的等级作为该株系旗叶干尖指数。

(2)千粒重热感指数:指株系在高温胁迫条件下千粒重性状值与对照条件下千粒重性状值的比较，计算公式为千粒重热感指数(S)＝(1－YD/YP)/，YD 为某一品种(系)在高温胁迫下的千粒重，YP 为某一品种(系)在正常环境下的千粒重，为品种(系)在高温胁迫处理下的千粒重均值，为品种(系)在正常环境下的千粒重均值。收获后利用万深SC－G 自动种子考种分析及千粒重仪测定RIL 群体及亲本千粒重。

1.2.3 数据处理与分析 利用SPSS 23.0 统计软件对小麦RIL 群体200 个株系及其亲本的旗叶干尖指数性状和千粒重热感指数性状进行相关分析和基本统计量分析。

1.3 群体全基因组SNP 芯片分析

利用北京中玉金标记公司与中国农业科学院作物科学研究所合作研发的15K 育种芯片对RIL群体200 个株系及其亲本的基因组进行高通量基因分型，并对样品及分析结果进行质控:①计算样品的DQC(Dish QC)和CR(call rate)值，判断样品数据是否适合进行后续基因分型分析；②SNP位点质控，标记质量分类，选择群体最优标记分型类型；③基因分型分析，根据Affymetrix (Thermo Fisher)的筛选标准[17]过滤标记，筛选后得到8 558个多态性位点用于遗传图谱构建。

1.4 遗传图谱构建

以菏麦13 和临麦2 号为亲本构建的RIL 群体为作图群体，对8 558 个多态性位点进行筛选:舍去杂合率高的标记(>10%)和缺失率高的标记(>10%)；应用Tassel v5.0 过滤偏分离标记(0.3 ∶0.7)。

通过QTL IciMapping v4.2 对标记初步分组。应用QTL IciMapping v4.2－Bin 功能整合同一位点的所有共分离标记，仅保留一个用于后续做图；QTL IciMapping v4.2 Map 过程识别基因型数据，根据连锁关系将标记分到小麦21 条染色体上。

应用JoinMap v4 构建全基因组遗传连锁图谱。对IciMapping 初步分组结果进行检验，Regression mapping 过程确定标记位置并计算遗传距离。

1.5 QTL 分析

利用Windows QTL Cartographer 2.5 软件，通过复合区间作图法(CIM)进行QTL 定位，设置程序扫描步长为1.0 cM，置换检测(permutation test)参数设置为P＝0.05 水平下1 000 次重复排列[18]。当位点LOD 阈值大于2.5 时，就认为此位点上存在一个QTL。QTL 命名方法[19]:q＋目标性状(大写英文字母)＋“－”＋所在染色体编号＋“－”＋QTL 序数。

2 结果与分析

2.1 遗传图谱

遗传图谱包含741 个SNP 标记，覆盖15 条染色体，全长1 720.43 cM，标记间平均距离2.32 cM(表1)。

表1 遗传图谱标记分布及密度

2.2 旗叶干尖指数和千粒重热感指数表型分析

2.2.1 旗叶干尖指数 两个亲本的旗叶干尖指数性状存在明显差异，菏麦13 具有较低的旗叶干尖指数，比临麦2 号低1～2 个等级(表2)。旗叶干尖指数在RIL 群体内表现出超高亲分离，呈正态分布或近似正态分布(图1)，属于多基因控制的数量遗传性状，可以进行QTL 定位。

图1 3 个环境下RIL 群体旗叶干尖指数分布

表2 RIL 群体及其亲本旗叶干尖指数的表型分析

2.2.2 千粒重热感指数 两个亲本的千粒重热感指数有明显差异，菏麦13 热感指数较低，具有较好的耐高温特性；临麦2 号则表现出明显的感高温特性，热感指数大于1.4(表3)。千粒重热感指数在RIL 群体内表现出双向超亲分离，分布图呈正态分布或近似正态分布(图2)，属于多基因控制的数量遗传性状，可以进行QTL 定位。

表3 RIL 群体及其亲本千粒重热感指数的表型分析

2.3 QTL 定位结果

2.3.1 旗叶干尖指数QTLs 在LOD>2.5 水平下，共检测到10 个旗叶干尖指数QTLs，分布于小麦的1A(2 个)、1B(2 个)、2A、4A、5B(2 个)、7A和7B 染色体上(表4 和图3)，可解释5.03%～13.11%的表型变异。其中1B 染色体定位到2 个QTLs(qFLS － 1B － 1和qFLS － 1B － 2)， AX －108920629～AX－111220018 区间内的qFLS－1B－1可解释9.47%的表型变异，LOD 值为4.64；AX－111608329～AX－111548801 区间内的qFLS－1B－2可解释12.44%的表型变异，LOD 值为2.70；两个QTLs 的加性效应均为负值，位点增效等位基因来源于母本菏麦 13。4A 染色体 AX －110410155～AX－95629274 区间内的qFLS－4A可解释13.11%的表型变异，LOD 值为2.60，加性效应为正值，位点增效等位基因来源于父本临麦2号。5B 染色体上定位到2 个QTLs(qFLS－5B－1和qFLS－5B－2)，AX－110490429～AX－111478844区间内的qFLS－5B－1 可解释9.13%的表型变异，LOD 值为2.85，加性效应为负值，位点增效等位基因来源于母本菏麦13；AX－108922118～AX－108930395 区间内的qFLS－5B－2可解释8.11%的表型变异，LOD 值为4.25，加性效应为正值，位点增效等位基因来源于父本临麦2 号。7B 染色体AX－108861535～AX－109325469 区间内的qFLS－7B在2019年济南、陵城两地均定位到，LOD 值在3.39～4.33，可解释6.53%～8.32%的表型贡献率，加性效应均为负值，位点增效等位基因来源于母本菏麦13，是稳定的QTL。

表4 旗叶干尖指数性状的QTL 定位结果

2.3.2 千粒重热感指数QTLs 在LOD>2.5 水平下，共检测到11 个千粒重热感指数QTLs，分布于2B、3A(2 个)、4B(2 个)、5A、5D、6A、6D、7B 和7D 染色体上(表5 和图3)，可解释4.89% ～15.60%的表型变异。3A 染色体上分别在2018年济南(qITKW－3A－1)和2019年陵城(qITKW－3A－2)定位到QTLs，表型贡献率分别为5.83%和12.54%，LOD 值分别为2.97 和2.62，加性效应均为正值，位点增效等位基因来源于父本临麦2 号。4B 染色体上也定位到2 个QTLs，分别是2018年济南定位到的qITKW－4B－1和2019年济南定位到的qITKW－4B－2，其表型贡献率分别为8.97%和6.33%，LOD 值分别为2.57 和3.32，加性效应均为负值，位点增效等位基因来源于母本菏麦13。6A 染色体AX－109536927～AX－95012251 区间内的qITKW－6A可解释15.60%的表型变异，LOD 值为3.22，加性效应为负值，位点增效等位基因来源于母本菏麦13。7B 染色体AX－108762687～AX－111137553 区间内的qITKW－7B在两年三点的定位中均检测到，LOD 值在2.58～4.69，可解释5.27%～9.15%的表型贡献率，加性效应均为正值，位点增效等位基因来源于父本临麦2 号，是稳定的QTL。

图3 RIL 群体耐热相关性状QTL 定位结果

表5 千粒重热感指数的QTL 定位结果

3 讨论与结论

小麦的耐热机制非常复杂[12]，其耐热性状是多基因控制的数量遗传性状[13]，同一染色体上可能存在多个有关耐热的QTL 位点，是小麦本身的遗传特性和环境共同作用的结果。本研究从灌浆期经历高温胁迫的小麦旗叶中定位到与旗叶干尖指数性状相关的QTLs 共10 个，分别位于1A(2个)、1B(2 个)、2A、4A、5B(2 个)、7A 和7B 染色体上。白海波等[20，21]以叶绿素含量作为耐热指标检测到与耐热相关的QTLs 分布在2A、5B、7A、7B 染色体上，Talukder 等[22]发现控制叶绿素的QTLs 分布在1B、7A 染色体，这些QTLs 虽然与本研究中的QTLs 定位在了相同的染色体，但距离相差较远，并不相同。Vijayalakshmi 等[23]在高温胁迫下在7A 染色体定位到与旗叶相关的QTL，与本研究定位到的qFLS－7A位置距离差异较小，预测在该位置附近存在与耐热相关的基因。1A、4A 染色体上检测到与耐热有关QTLs 前人还少有涉及，这可能与试验材料、所用芯片、鉴定方法等不同有关，但qFLS－4A可解释13.11%的表型变异，意味着可能存在与耐热相关的新基因未发掘，有待于进一步研究。

有关千粒重的QTLs 几乎分布在小麦各个染色体[24]，但与耐热性相关的相对较少。本研究在2B、3A(2 个)、4B(2 个)、5A、5D、6A、6D、7B 和7D 染色体上检测到11 个与千粒重热感指数相关的QTLs。与本研究结果相似的是，李世平等[25]利用DH 群体，在6A 染色体上定位到千粒重热感指数QTL，加性效应为负值；陈希勇等[14]研究指出，2B、3A、4B 染色体均与耐热性有关。但在5A染色体上检测到的qITKW－5A与张业伦等[4]检测到的qTKW－5A加性效应不同。白海波等[20]在高温胁迫下检测到控制千粒重的QTLs 分布于2A、2B、3B、4B、5D、6D 染色体上，与本研究结果不尽相同，也说明了小麦耐热机制的复杂性。

本研究检测到的控制旗叶干尖指数的QTLqFLS－7B在济南和陵城两地稳定存在，标记区间为AX－108861535～AX－109325469，加性效应为负值，位点增效等位基因来源于母本菏麦13。控制千粒重热感指数的QTLqITKW－7B在两年三点试验中稳定存在，标记区间为AX－108762687～AX－111137553，加性效应为正值，位点增效等位基因来源于父本临麦2 号。以旗叶干尖指数和千粒重热感指数两个性状为鉴定指标均在7B 染色体上定位到与耐热相关的QTL，表明7B 染色体上很可能存在响应高温胁迫的基因。白海波[20]、Paliwal[26]和Mohammadi[27]等均在7B 染色体上检测到与耐热性有关的QTL 也证实了这一推论。这可为进一步研究耐热机制及挖掘新的耐热基因提供一定的理论支撑。同时用于小麦耐热QTL定位的鉴定指标较多，选择合适且有效的鉴定指标有助于提高定位精度，加快育种进程，本研究以旗叶干尖指数和千粒重热感指数作为耐热鉴定指标取得了较好QTL 定位结果，可为选育小麦耐热新品种提供借鉴。