水分亏缺对小麦芒和旗叶光合特性及蔗糖、淀粉合成的影响

和 娟，唐 燕，李晓瑞，李海兰，周春菊，吕金印

(西北农林科技大学生命科学学院，陕西 杨凌 712100)

小麦是我国北方主粮作物，其总产量涉及到国家粮食安全，不同生长期的季节性干旱是造成中国北方冬小麦减产的主要原因[1]。小麦穗部非叶器官是除旗叶外重要的光合同化物来源[2]。芒作为穗部重要的光合器官，占穗部50%～60%的光合面积，潜在地增加了小麦对光的捕获[3-4]，对籽粒的光合贡献约占穗部净光合的50%[5]。大麦中芒光合可占穗部净光合作用的90%[6-7]。对小麦近等基因系(NILs)的研究表明，芒的存在增加了籽粒体积。但因籽粒数量减少，最终产量不一定增加，而籽粒数量减少可能是芒的生长消耗了碳同化物[8]，从而使可供小花原基发育的同化物分配量减少[9]。目前，有关芒的光合贡献仍存在争议，而更多的研究仍支持芒的存在是促进穗光合的主要因素[1,5,10-11]。

小麦穗部在干旱下可保持较高的渗透调节能力[13]，相比旗叶具有较高的相对水分含量[14]。研究表明，芒因其特殊的解剖结构而具有一定的抗旱保水能力[15]。蔗糖是植物中光合碳同化物运输的主要形式[16]，蔗糖合成酶(Sucrose synthase, SS)和蔗糖磷酸合酶(Sucrose phosphate synthase, SPS)是蔗糖合成的关键酶[17-18]。蔗糖合成酶催化果糖和核苷二磷酸(NDP)之间糖基部分的转移是可逆的(蔗糖+NDP↔NDP-葡萄糖+果糖)，其转化平衡与pH值有关，当7.5

干旱处理下，有关小麦芒等非叶器官对籽粒的光合贡献及其蔗糖淀粉合成酶活性与基因表达的研究较少，本研究于小麦灌浆期进行水分亏缺处理，测定籽粒灌浆过程中小麦旗叶和芒净光合速率、蒸腾速率、叶绿素含量和相对含水量等生理指标，分析蔗糖和淀粉含量及其合成关键酶活性与基因表达水平，以期为研究干旱胁迫下小麦生育后期穗部芒的光合贡献提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

本试验品种选用‘郑引1号’小麦，盆栽试验于2017年10月—2018年6月在西北农林科技大学遮雨网室中进行。使用上、下口直径和高分别为23、16 cm和18 cm的聚乙烯塑料桶；试验土壤类型为红油土，取自大田耕作层(0～20 cm)，风干后过筛(每公斤土拌入尿素0.447 g、磷酸二氢钾0.2 g)，播种前每盆装土6.5 kg(风干土含水量为14.7%)。每盆点播22粒小麦种子，于小麦三叶期定苗12株，同时剪去分蘖。本试验设置对照组(CK)和水分亏缺(WD)两组处理，土壤水分分别保持在田间持水量的70%～75%(CK)和40%～45%(WD)，土壤净含水量分别为20.51%～21.98%和11.72%～13.19%。本试验在开花前5 d开始控水，通过称重法每天按照控水标准补水，使每盆小麦土壤含水量于开花时达到控水标准。花后0、4、8、12、16、20、24 d上午9∶00采集小麦旗叶和芒，两组处理不同器官各采集3个生物学重复，称重后-80℃冰箱保存，待测其他指标。

1.2 测定项目与方法

1.2.1 光合参数的测定 根据Jia等的方法[22]，在花后0、4、8、12、16、20、24 d上午9∶00，选取对照(CK)和水分亏缺(WD)两组处理小麦植株，采用便携式光合测定系统(LI-6400XT，LiCor，USA)测定旗叶和芒的净光合速率(Pn)与蒸腾速率(E)，每个处理设5个生物学重复。芒光合参数的测定参考Hosseini等[23]和施生锦等[12]的方法,并做了一些修改，将芒迅速剪下整齐无重叠排列于标准叶室中，测定其光合参数。实际参与光合的芒表面积用Epson Perfection V800 photo根系扫描仪(SeikoEpson Corporation, Nagano Prefecture, Japan)测定。旗叶光合参数的测定按常规方法进行。

1.2.2 叶绿素含量(Chl)、相对水分含量(RWC)和丙二醛(MDA)含量的测定 叶绿素含量测定参照《植物生理学实验指导》的方法[24]。将旗叶和芒剪成0.5 cm长小段浸泡于25 ml 80%丙酮中，于黑暗中提取2 d至样品变白。过滤后的叶绿素提取液分别在663 nm和646 nm下测定吸光度，以80%丙酮为空白对照。每个处理设3个生物学重复。

RWC的测定参照Maydup等的方法[1]。采集不同处理芒、旗叶，称鲜重(wi)，浸泡于蒸馏水中，4℃处理过夜，取出称重(wf)，然后60℃下烘48 h至恒重，称重(wd)。每个处理设3个生物学重复。

MDA含量的测定参照Li等的方法[11]。将样品放入提前预冷的研钵中，加入3 ml 0.05 mol·l-1磷酸缓冲液(pH值7.8)研磨成匀浆，转移至10 ml离心管中，加入3 ml 0.5%硫代巴比妥酸溶液(用5%三氯乙酸溶解)，摇匀。沸水浴10 min后冷却，3 000 g离心15 min，取上清液测532、600 nm和450 nm处的吸光度，以0.5%硫代巴比妥酸溶液为空白。每个处理设3个生物学重复。

1.2.3 蔗糖含量、淀粉含量与可溶性糖含量的测定 提取液的制备参考张志良等[25]的方法，蔗糖含量测定用间苯二酚法[26]，可溶性糖和淀粉含量的测定采用蒽酮-硫酸法[25,27]。

1.2.4 酶活性测定 蔗糖合成酶(SS，合成方向)和蔗糖磷酸合酶(SPS)活性测定参考Wardlaw的方法[28]。腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)和可溶性淀粉合成酶(SSS)的活性测定根据Nakamura等的方法[29]进行。上述酶活性测定每个处理均设3个生物学重复。

1.2.5 蔗糖和淀粉合成关键酶基因表达差异的测定 RNA提取、cDNA合成及实时定量RT-PCR参照Li等的方法[30]。用Primer Premier 6.0设计引物，蔗糖和淀粉合成关键酶相关基因(SS1,SS2,SPS1,AGPase,SSS)引物及内参基因actin的引物见表1。基因表达水平的计算用2-ΔΔCT公式[32]。

表1 小麦芒和旗叶中蔗糖和淀粉代谢关键酶基因实时定量RT-PCR引物序列

1.3 数据处理与统计分析

用SPSS 22.0对数据进行单因素方差分析(ANOVA)，用Duncan多重比较(P<0.05)检验差异显著性，采用Graphpad prism 6.0绘图。

2 结果与分析

2.1 水分亏缺对芒和旗叶净光合速率和蒸腾速率的影响

小麦灌浆期旗叶净光合速率(Pn)呈持续下降趋势(图1A)。与正常供水处理(CK)相比，水分亏缺处理(WD)旗叶Pn下降速率较快。但芒Pn呈现先增后减趋势(图1C)，花后8 d达到峰值。与正常供水处理(CK)相比，水分亏缺处理花后16、24 d旗叶Pn分别下降了29.5%、87.7%，而芒Pn则分别下降了14.2%、11.4%。旗叶Pn降幅明显高于芒。旗叶和芒的蒸腾速率(E)表现出与Pn相似的趋势(图1B)，花后4 d芒E达到峰值(图1D)。与正常供水处理(CK)相比，水分亏缺处理花后20 d旗叶E下降了40.1%，而芒E则下降了20.9%。表明水分亏缺状态下小麦芒的Pn和E所受抑制小于旗叶，芒在两种处理下均表现出了一定的光合持久性。

2.2 水分亏缺对芒和旗叶叶绿素含量、相对水分含量和丙二醛含量的影响

在灌浆期小麦旗叶叶绿素(Chl)含量呈持续下降趋势(图2A)，芒Chl含量呈先增后减趋势，于花后8 d达到峰值(图2D)。与对照(CK)相比，水分亏缺处理(WD)旗叶Chl含量在花后20、24 d分别下降了58.0%、50.2%，而芒Chl含量在花后20、24 d分别下降了15.9%、9.9%，旗叶Chl含量降幅明显大于芒。表明水分亏缺状态下芒中叶绿素降解较慢，相比旗叶表现出了衰老延迟现象。

旗叶和芒相对水分含量(RWC)表现出与Chl相似的趋势。与对照(CK)相比，在花后20、24 d水分亏缺处理旗叶相对水分含量(RWC)分别下降了7.6%、13.9%(图2B)，芒RWC分别下降了2.1%、1.5%(图2E)。相比旗叶，芒有较好的保水能力，可能是其在水分亏缺下具有更高光合效率的原因之一。

旗叶和芒丙二醛(MDA)含量呈持续上升趋势，且旗叶MDA含量显著上升。与对照相比，水分亏缺处理花后4、12、24 d旗叶MDA含量分别增加了19.3%、19.4%、50.8%(图2C)，而芒在花后4、12、24 d分别增加了9.8%、14.5%、14.0%(图2F)。芒中MDA增幅明显小于旗叶。表明水分亏缺下芒的MDA积累少，相比旗叶具有较强的抗氧化能力，其膜脂过氧化对细胞的损伤程度相对较小。

2.3 水分亏缺对小麦芒和旗叶中蔗糖、淀粉和可溶性糖含量的影响

随着小麦灌浆进程旗叶和芒中蔗糖含量呈先升后降趋势，并在花后8 d达到峰值(图3A，3D)。与正常供水处理相比，水分亏缺处理旗叶蔗糖含量下降速率较快，花后4、12、24 d旗叶蔗糖含量分别下降了28.0%、33.7%、50.1%，芒蔗糖含量分别下降了13.7%、14.1%、18.2%，明显低于旗叶的降幅。芒和旗叶淀粉含量在灌浆过程中呈现出与蔗糖含量相似的趋势(图3B，3E)。与正常供水处理相比，水分亏缺处理灌浆中期(花后12 d)旗叶和芒中淀粉含量分别降低了19.5%、7.0%。在灌浆中后期，花后16、24 d水分亏缺下旗叶淀粉含量分别降低了23.3%、46.4%，芒中淀粉含量分别降低了8.1%、18%，降幅明显小于旗叶。说明水分亏缺下芒中蔗糖和淀粉含量受影响较小，为灌浆中后期籽粒中同化物的重要来源。

由于粗过滤器2016年下半年进行过内部检修，失效可能性较小而且粗过滤器拆检工程量相对较大，先对细过滤器进行开罐检查；滤料剩余不到一半，表面的无烟煤基本消失，而且滤料中大量泥土类杂质，基本确定细过滤器失效。

与蔗糖和淀粉含量变化类似，在灌浆期小麦旗叶和芒可溶性糖含量呈先上升后下降趋势，峰值出现在花后4 d(图3C，3F)。与正常供水处理相比，水分亏缺处理花后4、12、24 d旗叶可溶性糖含量分别下降了21.2%、14.1%、64.4%，芒中可溶性糖含量分别下降了10.6%、6.9%、16.2%，旗叶可溶性糖降幅明显高于芒。说明芒的可溶性糖含量受干旱胁迫的影响较小，其渗透调节能力更强。

2.4 水分亏缺对小麦芒和旗叶中蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合酶、腺苷二磷酸焦磷酸化酶和可溶性淀粉合成酶活性的影响

小麦灌浆期旗叶和芒蔗糖合成酶(SS，合成方向)活性呈先升后降趋势(图4A、4E)，花后8 d达到峰值。与正常供水处理相比，水分亏缺处理旗叶SS活性下降速率较快，花后8、24 d旗叶SS活性分别下降了15.0%和30.1%，而芒SS活性则分别下降了11.5%和8.3%，旗叶SS活性降幅明显高于芒。旗叶和芒的蔗糖磷酸合酶(SPS)活性表现出与SS相似的趋势，花后8 d达到峰值(图4B、4F)。与正常供水处理相比，花后8、24 d水分亏缺处理旗叶SPS活性分别下降了13.7%和36.0%，芒则分别下降了7.3%和14.8%，降幅明显小于旗叶。表明水分亏缺对芒中蔗糖合成关键酶活性影响较小。

小麦灌浆期旗叶和芒腺苷二磷酸焦磷酸化酶(AGPase)活性呈先升后降趋势，花后8 d达到峰值(图4C、4G)。与正常供水处理相比，水分亏缺处理旗叶和芒花后8 d AGPase活性分别下降了20.8%和8.4%；在灌浆中后期(花后12、24 d)，旗叶AGPase活性分别下降了27.8%和32.3%(图4C)，芒则分别下降了10.7%和7.9%(图4G)，旗叶AGPase活性降幅明显高于芒。旗叶和芒的可溶性淀粉合成酶(SSS)活性表现出与AGPase相似的趋势，花后8 d达到峰值(图4D、4H)。与正常供水处理相比，花后8 d水分亏缺处理旗叶和芒SSS活性分别降低了15.9%和10.2%；花后20、24 d旗叶SSS活性分别下降了27.8%和36.2%，芒分别降低了15.0%和7.0%，明显低于旗叶的降幅。说明在干旱处理下，相对于旗叶，芒中淀粉合成关键酶受到的损伤较小，在小麦灌浆中后期仍能保持一定的碳同化能力。

2.5 水分亏缺下小麦芒和旗叶蔗糖与淀粉合成相关基因表达差异

小麦灌浆期旗叶和芒中蔗糖合成酶基因(SS1、SS2)和蔗糖磷酸合酶基因(SPS1)表达水平呈先升后降趋势，花后4d达到峰值(图5)。与正常供水处理相比，花后4、12 d水分亏缺处理旗叶SS1表达水平分别下降了23.1%、30.4%，SPS1表达水平分别下降了11.8%、7.7%；而芒中SS1表达水平分别下降了9.5%、6.7%，SPS1表达水平分别降低了20.0%、9.5%，芒中基因表达水平降幅明显低于旗叶。水分亏缺下SS2表达水平整体呈逐渐下降趋势，花后4 d有小的增幅。与正常供水处理相比，花后4、12d水分亏缺下旗叶SS2表达水平分别下降了14.8%、25.0%，芒则分别下降了10.4%、12.5%，明显低于旗叶的降幅。在整个灌浆期旗叶与芒蔗糖合成相关基因表达水平变化趋势，与蔗糖合成相关酶活性变化趋势基本吻合，同时与蔗糖含量变化趋势一致。

与正常供水处理相比，水分亏缺处理花后4、12 d旗叶中AGPase表达水平分别下降了13.3%、16.7%，SSS表达水平分别下降了20.0%、14.3%；而芒中AGPase表达水平分别下降了6.3%、15.4%，SSS表达水平分别降低了6.3%、8.3%，芒中AGPase、SSS表达水平降幅明显低于旗叶。灌浆前中期(花后4、8、12 d)淀粉合成相关基因表达水平上升，与淀粉含量和淀粉合成关键酶活性变化趋势一致。

3 讨 论

旗叶是小麦的主要光合器官，但近年来有研究表明，穗光合对小麦产量贡献显著，尤其是在水分亏缺下[32]。当小麦旗叶光合作用在花后逐渐下降时，穗部仍然保持一定光合活性，尤其是在灌浆中后期穗部依然可为生长的籽粒提供光合产物[22]。芒着生于穗部顶端，有更大的光合面积，便于获取光能，使其在光合作用方面更有优势[33]。本研究表明，在小麦灌浆过程中，旗叶净光合速率(Pn)和蒸腾速率(E)在灌浆中后期快速下降，而芒Pn和E降幅明显小于旗叶。与正常供水处理相比，水分亏缺处理芒的Pn和E降幅明显小于旗叶。表明水分亏缺下芒在灌浆中后期仍能保持一定的光合能力，在灌浆后期可保持比旗叶更高的光合效率。

相比于旗叶，水分胁迫下颖壳和芒更好的水分状态与其更强的渗透调节能力和更高的相对水分含量有关[2]。本研究中水分亏缺下旗叶叶绿素(Chl)含量和相对水分含量(RWC)随着灌浆进程快速下降，而芒Chl含量和RWC在灌浆中后期降幅明显小于旗叶。相比于旗叶，水分亏缺下芒具有衰老延迟性和更好的保水性。水分亏缺下芒中MDA含量增幅明显小于旗叶，芒具备更强的抗氧化能力。这些特性均为芒保持一定的光合速率奠定了基础。

4 结 论

1)灌浆期水分亏缺处理对小麦旗叶光合作用的影响较芒显著(P<0.05)，随着灌浆的进行，旗叶和芒Pn、Chl含量和RWC均呈下降趋势，与CK处理相比，花后24 d旗叶Pn、Chl含量和RWC分别下降了87.7%、54.1%和13.9%，芒中则分别下降了14.4%、12.3%和1.5%。相比旗叶，芒表现出保水性和光合持久性。

2)灌浆期水分亏缺处理对小麦旗叶光合碳同化物合成的影响较芒显著(P<0.05)。灌浆期间旗叶和芒中蔗糖、淀粉含量及其合成关键酶的活性和基因表达水平均下降，特别是在灌浆中后期，旗叶中降幅明显大于芒，表现出芒持续合成光合产物的能力。

3)灌浆期间水分亏缺下芒中丙二醛含量增幅显著小于旗叶，表现出更强的抗氧化能力；可溶性糖含量降幅显著小于旗叶，有更强的渗透调节能力。