仙鹤草通过诱导肿瘤细胞凋亡和自噬抑制肝癌裸鼠移植瘤生长

姚雪瑞，党 振，孙 雪，忽书霞

（南阳医专第二附属医院药械科，河南南阳 473000）

肝癌是严重的人类恶性疾病之一，被列为与肿瘤死亡相关的第二大常见原因。更为严重的是，肝癌的发病率和死亡率一直在上升，尤其是在东南亚国家[1]。尽管最近几年在疾病诊断和治疗方面取得了进展，但是肝癌患者的长期预后仍然很差，对于晚期肝癌患者，由于失去了通过手术切除和肝移植进行有效治疗的可能性，总体5年生存率＜5%[2]。

来自植物的天然化学物质和代谢产物，由于其低毒性和潜在的生物学活性，在治疗和预防癌症方面的药理作用日益受到关注。仙鹤草（Agrimonia Pilosa Ledeb，APL）是蔷薇科植物龙芽草的干燥地上部分，临床上常用于治疗脱力劳伤、痈肿、肺痈、痔肿等。《葛祖方》中记载：“滚咽隔之痰，平翻胃之秽”，说明仙鹤草对食道癌和胃癌的抗肿瘤活性。已有研究表明，仙鹤草抑制HepG2癌细胞增殖，促进其凋亡[3]，对H22肝癌皮下移植瘤小鼠肿瘤生长具有抑制作用[4]。本研究通过建立肝癌裸鼠移植瘤模型，探究仙鹤草对肝癌裸鼠移植瘤的抑制作用及其机制，以期为仙鹤草的抗肿瘤作用提供更多的实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

25只SPF级裸鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，雄性，6周龄，体重20±3g，许可证号：SCXK（京）2015-0001。饲养房保持湿度30%，气温20～25℃，每周更换灭菌垫料，按时添加裸鼠饲料及饮水。

1.2 实验药物和主要试剂

仙鹤草（豪州市泽信堂药业有限公司）；5-氟尿嘧啶（上海源叶生物科技有限公司）；人肝癌细胞系HepG2（中国典型培养物保藏中心）；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒和辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG均购自上海碧云天生物技术研究所；Ki67免疫组化试剂盒和VEGF免疫组化试剂盒均购自上海雅吉生物科技有限公司；兔抗Caspase-3、Bax、Bcl-2、LC3-I/LC3-II、Beclin1、p62和GAPDH单克隆抗体均购自英国Abcam公司。

1.3 仙鹤草水提物制备

取仙鹤草干燥全草50g，加水1000ml，浸泡1h后，煎煮30min，滤出水煎液。再将滤出的仙鹤草水煎液煎煮30min，重复3次。合并3次滤液加热浓缩至250ml（每1ml水煎液约等于0.2g原药材），冷冻保存。

1.4 动物模型建立及分组

取对数生长期HepG2细胞，用培养基重悬并调整细胞浓度为1×107/mL，75%的酒精消毒裸鼠皮肤后，于裸鼠右侧腋窝处皮下注射0.2ml细胞悬液。接种后14d可见肿瘤生长，当肿瘤体积生长至80～100 mm3后，将荷瘤裸鼠随机分成5组：对照组（Control）、仙鹤草低剂量组（APL 6g/kg）、仙鹤草中剂量组（APL 12g/kg）、仙鹤草高剂量组（APL 24g/kg）和5-氟尿嘧啶组（5-FU 20mg/kg）。仙鹤草低、中、高剂量组每日分别灌胃仙鹤草6、12、24g/kg[5]，5-FU组每日腹腔注射5-氟尿嘧啶20mg/kg[6]，Control组每日灌胃等量生理盐水，连续30d。

1.5 肿瘤重量

30d后处死裸鼠，完整切取肿瘤组织，电子天平称取肿瘤重量。

1.6 肿瘤体积

模型建立后，从第0d起每隔5d记录所成瘤的长径和短径，体积=长径×短径2×1/2。在第30d记录下移植瘤的长径和短径后，断颈法处死裸鼠。

1.7 TUNEL染色

取部分肿瘤组织，制作石蜡切片，常规脱蜡至水；将切片浸入0.1M pH=6.0柠檬酸缓冲液中，于微波炉中处理5min，PBS洗2次；加TUNEL反应液湿盒中37℃暗反应1h，PBS洗3次；玻片干后加过氧化物酶（POD）至切片上，湿盒中37℃反应30min，PBS洗3次；加DAB室温下反应10min后，复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光学显微镜下观察并随机选择5个视野拍照，使用Image J分析。

1.8 Western blot

取各组裸鼠肿瘤组织，称重后剪碎匀浆，加含蛋白酶抑制剂的裂解液于冰上充分裂解，并用BCA试剂盒测定蛋白质含量；提取等量蛋白质样品，100℃变性5min。然后进行SDS-PAGE凝胶电泳分离并转移至PVDF膜，5%的BSA室温封闭2h后加入Caspase-3、Bax、Bcl-2、LC3-I、LC3-II、Beclin1和p62一抗，4℃过夜孵育，次日，清洗后再加入辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG，室温孵育1h，清洗。最后加入发光液后，于凝胶成像仪进行曝光拍照，并用ImageJ软件统计灰度值计算相对表达量。

1.9 免疫组化

取各组肿瘤组织，常规石蜡包埋制成厚度约4μm的切片，按免疫组化检测试剂盒说明书进行免疫组化染色，DAB显色试剂盒显色，苏木素复染，盐酸酒精分色，光学显微镜观察Ki67、VEGF在肿瘤组织中的表达情况。

1.10 统计学分析

采用SPSS 18.0软件进行统计学分析。正态分布计量资料以 表示，采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 仙鹤草降低肝癌裸鼠移植瘤肿瘤重量和体积

检测各组裸鼠肿瘤重量、体积结果如图1所示，与Control组比较，APL 6g/kg组裸鼠肿瘤重量、体积显著降低（P＜0.05），APL 12、24g/kg组和5-FU 20mg/kg组裸鼠肿瘤重量、体积显著降低（P＜0.01）。

图1 仙鹤草对肝癌裸鼠移植瘤肿瘤重量、体积的影响

2.2 肿瘤组织细胞凋亡

通过TUNEL染色检测隔离裸鼠肿瘤组织凋亡结果如图2A所示，与Control组比较，APL 6g/kg组裸鼠肿瘤组织细胞凋亡率显著升高（P＜0.05），APL 12、24g/kg组和5-FU 20mg/kg组裸鼠肿瘤组织细胞凋亡率显著升高（P＜0.01）。

图2 仙鹤草对肝癌裸鼠移植瘤肿瘤组织细胞凋亡的影响

2.3 Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达水平

通过Western blot检测各组裸鼠Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达水平结果如图3所示，与Control组比较，APL 6g/kg组Caspase-3、Bax蛋白水平显著升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白水平显著降低（P＜0.05），APL 12、24g/kg组和5-FU 20mg/kg组裸鼠肿瘤组织细胞凋亡率显著升高（P＜0.01），Bcl-2蛋白水平显著降低（P＜0.01）。

图3 仙鹤草对肝癌裸鼠移植瘤Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达水平的影响

2.4 LC3-I、LC3-II、Beclin1和p62蛋白表达水平

通过Western blot检测各组裸鼠LC3-I、LC3-II、Beclin1和p62蛋白表达水平结果如图4所示，与Control组比较，APL 6g/kg组LC3-II/LC3-I比值和Beclin1蛋白水平显著升高（P＜0.05），p62蛋白水平显著降低（P＜0.05），APL 12、24g/kg组和5-FU 20mg/kg组LC3-II/LC3-I比值和Beclin1蛋白水平显著升高（P＜0.01），p62蛋白水平显著降低（P＜0.01）。

图4 仙鹤草对肝癌裸鼠移植瘤LC3-I、LC3-II、Beclin1、p62蛋白表达水平的影响

2.5 Ki67、VEGF阳性细胞数

通过免疫组化检测各组裸鼠Ki67、VEGF阳性细胞数结果如图5所示，与Control组比较，APL 6 g/kg组Ki67、VEGF阳性细胞数显著降低（P＜0.05），APL 12、24g/kg组和5-FU 20mg/kg组Ki67、VEGF阳性细胞数显著降低（P＜0.01）。

图5 仙鹤草对肝癌裸鼠移植瘤Ki67、VEGF阳性细胞数的影响

3 讨论

原发性肝癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，预后极差。化学疗法是晚期肝癌的主要治疗方法，但是现有的化学疗法存在疗效差和不良反应等问题[7]。因此，探寻提高生存率的新治疗方法至关重要。近年来的研究表明，仙鹤草具有确切的抗肿瘤作用[8]。张婷婷等[9]研究发现，仙鹤草水提物具有抑制HepG2细胞增殖，促进细胞凋亡的作用。本研究发现，仙鹤草能够有效的降低肝癌裸鼠移植瘤肿瘤重量和体积，抑制裸鼠移植瘤的生长，进一步确认了仙鹤草的体内抗肿瘤作用。

细胞凋亡是肿瘤细胞应对异常和细胞损伤的重要细胞机制，在人类癌症的发生发展中十分常见，诱导肿瘤细胞凋亡是肿瘤治疗最基本的策略[10]。Caspase3属Caspase家族中的凋亡执行因子，其凋亡级联中过度活化能够促进细胞凋亡，也表示凋亡进入不可逆阶段[11]。Bax和Bcl-2属于Bcl-2基因家族成员，Bax/Bcl-2比值反应了细胞的凋亡状况[12]。本研究发现，仙鹤草具有上调肝癌裸鼠移植瘤Caspase-3、Bax蛋白表达水平，下调Bcl-2蛋白表达水平的作用。提示仙鹤草促进肝癌裸鼠移植瘤肿瘤组织细胞凋亡。

自噬是细胞一种自我降解的过程，当细胞受到外界刺激或能量缺乏时，机体通过溶酶体将细胞内多余和损伤的细胞器进行降解，进行循环利用。自噬可以在凋亡缺陷细胞中起到替代细胞死亡机制，通过这种机制，可以抑制肿瘤的发生与发展[13]。自噬蛋白LC3可分为LC3-I和LC3-II两种，LC3-II定位在双层膜和自噬体上，是自噬体的特异性标志分子，LC3-II/LC3-I的比值与自噬泡的数量呈正相关，其比值大小是判定自噬水平的高低的依据[14]。相关研究表明，Beclin1表达下调可降低细胞自噬能力，增加肿瘤发生的几率[15]。当自噬受到抑制，p62上游表达增强或下游降解被阻断导致p62大量聚集，因此p62水平可作为自噬流的检测指标[16]。本研究发现，仙鹤草具有升高肝癌裸鼠移植瘤LC3-II/LC3-I比值和Beclin1蛋白表达水平，降低p62蛋白表达水平的作用。提示仙鹤草促进肝癌裸鼠移植瘤肿瘤组织细胞自噬。

VEGF在多种恶性肿瘤的病理组织中表达，其阳性表达率的升高往往表明恶性肿瘤细胞的血管生成增强，细胞转移的风险增加[17,18]。Ki67的高表达与肝肿瘤的恶性程度和复发率呈正相关。本研究发现，仙鹤草具有降低肝癌裸鼠移植瘤Ki67、VEGF阳性细胞数的效果，表明仙鹤草抑制了肝癌裸鼠移植瘤肿瘤细胞的增殖，通过抗肿瘤血管生成对肝癌裸鼠起到治疗作用。

综上所述，本研究表明了仙鹤草可抑制肝癌裸鼠移植瘤模型肿瘤的生长，其作用机制可能通过促进肿瘤细胞凋亡或自噬实现。