过表达环状RNA-103809调节乳腺癌细胞氧化应激和免疫

刘阿敏，赵文斌，陈保平

（1.商丘市第五人民医院中医外科，河南商丘 476000；2.郑州市中心医院）

乳腺癌是最为常见的女性恶性肿瘤，其发病率高居女性恶性肿瘤的第1位，死亡率占第2位，严重危害女性身心健康[1]。尽管乳腺癌的早期诊断及治疗已取得一定进展，但患者整体预后仍不理想，仍需要探究更为有效的生物靶标。环状RNA（circular RNA，circRNAs）是生物体内稳定存在的一类环状非编码RNA，具有重要的基因调控功能[2]。越来越多的研究数据表明，circRNAs参与人类多种肿瘤的发生发展过程[3,4]。最新研究显示，circRNA-103809（circ103809）可通过调节微小RNA-532-3p的表达，抑制乳腺癌细胞的增殖和转移[5]。但国内关于circ103809与乳腺癌的报道较少，且circ103809对乳腺癌是否还具有其他的调控途径尚不清楚。本研究以乳腺癌细胞MCF-7为研究对象，构建circ103809过表达细胞系，观察过表达circ103809对MCF-7细胞的调节作用，并初步分析其作用机制，旨在为乳腺癌寻找新型肿瘤生物标志物和治疗靶点提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株及主要试剂

乳腺癌细胞MCF-7（美国ATCC细胞库），胎牛血清、DMEN培养基（美国Gibco），pcDNA空质粒、circRNA-103809过表达质粒由广州吉赛生物科技股份有限公司提供，Trizol试剂（美国Invitrogen），反转录试剂盒（美国Promega），生化试剂盒、酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒（南京建成生物工程研究所），JC-1染色工作液、ECL发光试剂（上海碧云天生物有限公司），蛋白一抗（美国Abcam）。

1.2 细胞培养与转染

经含有10%胎牛血清的DMEM培养基悬浮培养MCF-7细胞，置于37℃、5%CO2环境下培养，待细胞融合至80%时，添加胰蛋白酶液进行消化，取对数生长期细胞随机分为空白对照（Control）组、阴性对照（Vector）组和circ103809组，Vector组和circ103809组分别转染pcDNA空质粒、circRNA-103809过表达质粒，24h后收获细胞。

1.3 实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测

用Trizol试剂裂解细胞提取总RNA，参照反转录试剂盒说明书合成cDNA，再进行qRT-PCR扩增，以GADPH为内参，计算circ103809、白细胞介素（IL-6、IL-10）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA的表达。反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性5s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环。

1.4 克隆形成实验检测细胞生长

取各组细胞调整浓度接种至12孔板，细胞数为100/孔，培养14d，每3d更换一次培养基，培养终止时吸弃培养基，固定于4%多聚甲醛中，加入适量结晶紫染色，光镜下计数并拍照，以细胞数≥50个为集落形成标准，计算细胞集落形成率（细胞集落数/初始接种细胞数×100%）。

1.5 氧化应激标记物的检测

收集各组细胞充分裂解后，8000r/min离心10min，取上清液，参照生化试剂盒说明书操作，检测细胞中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malonaldehyde diethyl acetal，MDA）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）的含量。

1.6 流式细胞术检测线粒体膜电位

收集各组细胞，添加1ml JC-1染色工作液混匀，37℃下孵育20min，再用JC-1缓冲液洗涤细胞，以完全培养基重悬细胞，上流式细胞仪检测，其中JC-1单体检测为绿色荧光（线粒体膜电位低），JC-1复合物为红色荧光（线粒体膜电位高）。

1.7 蛋白印迹（Western blot）法检测细胞中相关蛋白的表达

用RIPA裂解液提取细胞中总蛋白，以50μg左右蛋白上样，经10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离蛋白，再冰浴下电转至PVDF膜上，置于5%脱脂奶粉中封闭2h，然后4℃下孵育一抗（稀释比为1:1000）过夜，37℃下孵育二抗（1:8000）1h，最后经ECL试剂进行化学发光显示蛋白条带，应用Image J软件进行分析条带灰度值。

1.8 ELISA检测细胞炎症因子的含量

收集各组细胞充分裂解后，8000r/min离心10min，取上清液，参照ELISA试剂盒说明书操作，检测细胞中IL-6、IL-10和iNOS的含量。

1.9 免疫荧光检测细胞中p65的表达

相应处理后取出细胞爬片，置于4%多聚甲醛中固定15min，通透处理后置于山羊血清中封闭30min，再加入兔抗人p65抗体（稀释比为1:100），4℃下孵育过夜，次日加入FITC标记的山羊抗兔荧光二抗（稀释比为1:100），37℃下孵育1h，DAPI工作液染色10min，荧光显微镜下观察并计数细胞总数和p65入核的细胞数，计算p65入核阳性率。

1.10 统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件分析处理数据，以均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞中circ103809的表达

与Control组比较，circ103809组中circ103809的相对表达量明显升高（P＜0.05），而Vector组的circ103809表达无明显变化（P＞0.05），如图1。

图1 细胞中circ103809的表达与Control组比较，aP＜0.05

2.2 过表达circ103809对细胞增殖的影响

与Control组比较，circ103809组细胞集落形成率、Ki67、PCNA蛋白相对表达量明显降低，p21蛋白相对表达量明显升高（P＜0.05），但Vector组上述指标无明显变化（P＞0.05），如图2。

图2 过表达circ103809对细胞增殖的影响

2.3 过表达circ103809对细胞氧化应激水平的影响

与Control组比较，circ103809组细胞中SOD含量明显降低，GSH和MDA含量明显升高（P＜0.05），但Vector组上述指标无明显变化（P＞0.05），如图3。

图3 过表达circ103809对细胞氧化应激水平的影响

2.4 过表达circ103809对细胞线粒体损伤的影响

与Control组比较，circ103809组细胞中绿色荧光信号增强，Bax/Bcl-2水平明显升高，c-Myc蛋白相对表达量明显降低（P＜0.05），但Vector组上述指标无明显变化（P＞0.05），如图4。

图4 过表达circ103809对细胞线粒体损伤的影响

2.5 过表达circ103809对细胞炎症因子和p65水平的影响

与Control组比较，circ103809组细胞中IL-6、iNOS表达和p65入核阳性率明显降低，IL-10表达明显升高（P＜0.05），但Vector组上述指标无明显变化（P＞0.05），如图5。

图5 过表达circ103809对细胞炎症因子和p65水平的影响

3 讨论

随着高通量测序技术和生物信息学分析的飞速发展，学者们发现哺乳动物中存在大量的circRNA。 circRNA由于其特殊的环状结构，在哺乳动物细胞中具有高度的稳定性和保守性，可介导多种途径参与机体生物学进展，如调控亲本基因、充当蛋白质复合物的支架、作为微小RNA（miRNAs）分子的海绵等[6,7]。人源circ103809位于染色体5p13.3上，长度为693个核苷酸，在不同的恶性肿瘤中发挥不同的生物学作用。Liu等[8]研究发现，circ103809可螯合miR-4302上调癌基因MYC表达，从而促进肺癌的发生发展。而Li等[9]研究指出，circ103809可作为miR-620的海绵，抑制肝癌细胞的增殖和侵袭。本研究通过脂质体转染技术构建过表达circ103809的MCF-7细胞株，经克隆形成实验表明，过表达circ103809可明显抑制细胞增殖。Ki67、PCNA均属于细胞核增殖抗原，与DNA的合成密切相关，常用来评价细胞增殖活性，而p21则是一种细胞周期抑制蛋白，可使细胞周期停止在G1期，并具有广泛的激酶抑制活性[10,11]。Western Blot检测结果显示，相较于对照组，circ103809组细胞中Ki67、PCNA表达下调，p21表达上调，提示过表达circ103809可能通过调控上述细胞周期蛋白表达，进而抑制乳腺癌细胞的增殖。

当机体氧化与抗氧化平衡被打破时，可能导致引物DNA、蛋白质、线粒体细胞器等氧化损伤[12]。SOD是机内主要的抗氧化酶，GSH则是过氧化物分解酶，这两种酶类在机体抗氧化防御系统中有重要作用[13]。MDA作为脂质过氧化物的产物之一，可反映细胞内脂质过氧化反应水平[14]。本研究中，过表达circ103809后，细胞中SOD、GSH水平降低，MDA水平升高。线粒体损伤主要包括线粒体结构受损、功能紊乱及通透性增加，一般受损的线粒体可通过自噬维持肿瘤细胞的稳定，但过多的受损线粒体无法及时清除时，将介导Bax/Bcl-2通道极化形成孔道，释放大量毒性物质进入细胞质，最终导致细胞死亡[15]。本研究通过JC-1探针检测circ103809对线粒体膜电位的影响，结果显示，与对照组比较，circ103809组细胞JC-1聚合物在线粒体上聚集明显减少，Bax/Bcl-2水平升高，原癌基因c-Myc表达降低，表明过表达circ103809可能通过提升细胞内氧化应激水平，诱导线粒体损伤，进而抑制MCF-7细胞。

除了肿瘤细胞侵袭与迁移外，炎症反应也是乳腺癌恶化的重要因素。大量研究证实，慢性炎症与乳腺癌细胞特性的维持密切相关[16,17]。p65是炎症反应中的关键转录因子，当外界因素刺激致使p65发生核易位后，可调控一系列与炎症反应有关基因的表达，产生大量的炎性细胞因子，其中IL-6为强效的促炎因子，IL-10为抗炎因子[18]。同时p65的活化还可激活iNOS等相关酶类，进一步放大级联式炎症反应，激活炎症介质趋化及相关炎症细胞[19]。本研究结果显示，上调MCF-7细胞中circ103809水平后，IL-6、iNOS表达和p65入核阳性率明显降低，IL-10表达明显升高，提示过表达circ103809可能通过减轻细胞中炎症反应水平，从而对乳腺癌细胞起抑制作用。

综上所述，过表达circ103809可抑制乳腺癌细胞MCF-7的增殖，可能与促进氧化应激水平、减轻炎症反应有关，但其具体的分子作用机制还有待进一步研究。