儿童腹泻病原体常用检测方法研究进展*

约尔兰姆·托合提，陆 妍，朱雨悦 综述，金 玉△ 审校

1.南京大学医学院，江苏南京 210093；2.南京医科大学附属儿童医院消化科，江苏南京 210008

感染性腹泻是指由病毒、细菌、真菌或寄生虫引起的以腹泻为主要临床表现的胃肠道传染病，其对儿童健康造成极大威胁[1]。据《柳叶刀》杂志报道，2019年腹泻是5岁以下儿童死亡的第三大原因，占全球5岁以下儿童死亡人数的9.9%(95%CI：9.0%～28.0%)[2]。近3年全球新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染情况的相关研究表明，腹泻是SARS-CoV-2感染患儿的常见临床表现，并且从粪便排出病毒的时间可持续50 d[3-4]。因此，快速、准确地检测引起腹泻的病原体显得尤其重要。早期诊断和治疗可改善腹泻患儿预后，降低医疗成本，而腹泻病原体的快速检测是感染性腹泻早期诊断和合理用药的基础[5-7]。目前常见的腹泻病原体检测方法大致分为两类，即传统检测方法和新型分子诊断方法。然而，这些方法的检测效率因原理和目标的不同而有所差异，本文总结了目前临床上常见的传统和新型腹泻病原体检测方法，以期为临床提供参考。

1 传统检测方法

1.1显微镜检测 显微镜检测又称为镜检法、涂片法，临床上主要用于疑似隐孢子虫、蓝氏贾第鞭毛虫等寄生虫感染患儿的实验诊断[1,8]。镜检法的优势在于无须使用额外试剂，检测周期短，可同时检测2种以上的腹泻病原体。然而，镜检法需要集卵或特殊染色，灵敏度低，结果客观性欠佳，要求检查者具有丰富的专业知识和检测经验[8-9]。

1.2免疫学检测技术 临床上应用比较广泛的免疫学检测技术有金标免疫层析法(金标法)和酶联免疫吸附试验(ELISA)。二者主要基于抗原抗体的特异性结合及显色反应原理来检测腹泻患儿粪便中轮状病毒、诺如病毒、艰难梭菌等病原体抗原[10]。其中，金标法具有操作简便、快速、成本低的优点，只需肉眼判断显色带颜色，无须借助额外仪器[10-11]。然而，金标法受显色反应信号强度、病原体载量等因素影响，灵敏度低于常规聚合酶链反应(PCR)[12]，并且通常是单一病原体检测，无法对复合感染的患儿进行全面诊断[11]。相对金标法，ELISA更灵敏、特异，而且通量高，如单次检测标本可达96份；但是随着金标法的出现，我国ELISA在儿童感染性腹泻病中应用逐渐减少，主要是因为该检测方法需要配备酶标仪，且操作步骤较多，检测时间较长[9,13]。

1.3培养法 培养法在儿童腹泻病原体检测中应用广泛，用于大多数细菌或真菌的鉴定及耐药性检测，为抗菌药物的合理使用提供参考[14-15]。与镜检法、免疫学检测比较，培养法主要优点是通量高、特异度高、检测成本低[10]。然而，该方法最大的缺点是检测时间长，获取检测结果的时间有数天不等，这导致急性腹泻患儿病原学诊断的延迟[5]。此外，该方法灵敏度低，结果受抗菌药物使用、病原体载量、培养基选择性等因素影响[14,16]，并且操作步骤繁杂，常需要手动操作。

1.4常规PCR PCR通过DNA互补配对进行DNA体外合成，并对相应基因片段进行检测。目前，逆转录PCR(RT-PCR)、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)在儿童感染性腹泻的实验室诊断及研究中应用广泛，主要用于轮状病毒、诺如病毒等单一病原体的鉴定和亚型的鉴别[13]。PCR灵敏度高于镜检法、免疫学检测和大便培养，能鉴定低载量病原体[9,16]。然而，该方法只能针对临床高度怀疑的病原体进行检测，检测目标单一，存在假阴性的可能[14]。另外，实验中的有机溶剂残留物等对DNA合成有抑制作用，有假阴性的风险[16]。

2 新型分子诊断方法

新型分子诊断方法在病原体核酸或者基因片段水平上明确病原体。常用技术有核酸扩增法、基因芯片法和高通量测序等，但是临床上应用更广泛的是基于这些分子诊断技术的众多商业化检测板或检测系统，以提高病原体检测效率。新型分子诊断方法可以同时检测多种病原体[1]，并在病原体未知的情况下检测可能的致病原[17-18]。然而，也有研究提到，由于新型分子诊断技术灵敏度高，甚至可检测到极低载量病原体，而患儿可能并无相应症状，因此检测结果需结合临床进行合理解释[19]。

2.1FilmArray胃肠道感染检测板(FA-GP) 美国BioFire公司的FA-GP是以多重荧光PCR技术为基础的自动化检测板[6]。AXELRAD等[7]将FA-GP和传统方法(镜检法、ELISA法、细菌培养法)检测结果相比较，结果显示FA-GP总检出阳性率(29.2%)明显高于传统方法(4.1%)，并且FA-GP的使用可以有效地减少内镜检查、放射性检查和抗菌药物的使用。与其他新型分子诊断方法比较，FA-GP具有高度自动化、快速、灵敏度高的特点，其检测性能的评估一直是研究热点[6-7,18]。

2.2Luminex胃肠道病原检测板(GPP) 美国Luminex公司的GPP是基于多重PCR技术和微球杂交阵列综合应用的检测板[18,20]。一项临床研究结果显示，GPP检测慢性腹泻患儿的临床粪便标本的阳性率远高于传统方法(镜检法、ELISA法、细菌培养法)，而且GPP对肠道病原体检测的灵敏度和特异度均较高[15]。一项Meta分析显示，GPP和FA-GP这两种新型检测板均可为早期识别腹泻病原体提供重要的诊断信息，而对于大多数腹泻病原体而言，GPP灵敏度和后验概率较FA-GP低[21]。

2.3BD Max检测系统 常用的BD Max检测系统为美国BD公司的肠道病原体测试及BD Max肠道细菌扩展检测板。BD Max肠道病原体测试是以多重PCR技术为基础的病原检测方法。BD Max肠道病原体测试包括3个独立模块，分别用于检测常见细菌、病毒和寄生虫，各模块可单独选择或叠加使用[20]。BD Max肠道扩展检测板，用于检测小肠结肠炎耶尔森氏菌、产肠毒素大肠杆菌、弧菌和志贺单胞菌，作为对常用细菌模块的补充[22]。大多研究仅评价了BD Max单个模块的检测表现。例如，STOKES等[23]报道，BD Max病毒测试与PCR扩增联合测序比较，二者对粪便标本中的诺如病毒、札如病毒、星状病毒、轮状病毒和腺病毒检测的阳性符合率分别为92.8%、84.9%、93.0%、100.0% 和 95.6%，阴性符合率均≥99.4%，结果表明BD Max病毒测试可有效诊断由以上病毒引起的肠道疾病，适用于肠道病毒高危患者的临床筛查。BD Max检测系统的特点是针对不同病原体设有4种检测模块，可以根据需要进行选择，便于携带和操作[22-23]。同样，如果对模块选择不当，可能会导致病原体漏检。

2.4Seegene Allplex胃肠病原检测系统(Seegene Allplex-GI) 韩国Seegene公司的Seegene Allplex-GI是一种基于qRT-PCR技术的病原体检测方法[7]。与BD Max检测系统类似，该检测系统针对常见细菌、少见细菌、病毒、寄生虫有4种病原体检测模块[20,24]。各模块可根据患儿的临床表现单独选择或叠加使用，如大便隐血试验阳性者可选用两种细菌检测模块的组合[7]。MARTN等[25]将Allplex细菌检测模块与大便培养联合质谱鉴定进行比较，结果显示，在394份临床粪便标本中，二者的检出阳性率分别为66.2%和27.7%；将结果不一致的标本经多重PCR验证时发现，大便培养联合质谱鉴定漏检了44份标本，而Allplex漏检了5份标本；Allplex细菌检测模块对引起儿童腹泻的病原体的灵敏度和特异度均>95%。该系统还可鉴别轮状病毒、诺如病毒和腺病毒等5种常见病毒的不同基因型，这有助于儿童病毒性腹泻的流行病学观察和研究[26]。但由于与BD Max同样包含多个检测模块，Allplex系统也同样具有可选择性高的优点和漏检的风险[20]。

2.5QIAstat-Dx胃肠病原检测板(GIP) GIP是一种集成了核酸提取、PCR和荧光扩增检测的多重PCR系统。一项多中心临床研究采用385份粪便标本评估GIP的检测性能，并与FA-GP进行比较，将结果不一致的标本采用Allplex系统进行验证，结果显示GIP的检测灵敏度为98.2%，提示GIP检测范围广，灵敏度好[27]。研究显示，GIP可用于儿童腹泻病早期诊断，从而降低病原体传播的风险，进一步降低医疗费用[27-28]。

2.6TaqMan微流控芯片(TAC) 美国Life Technologies公司的TAC是一种qRT-PCR技术和微流控芯片相结合检测系统[29]。TAC对每份标本可检测48种目标病原体，并且可以根据需要定制病原体测试模块[30]。其中，病毒测试可检测胃肠炎病毒不同基因型，而细菌测试可检测大肠埃希菌的耐药基因[31-32]。一项多中心研究对比GPP、多重PCR和TAC对15种肠道病原体的检测性能，并与细菌培养、ELISA、常规PCR进行了比较[16]。结果显示，GPP、多重实时PCR和TAC对15种肠道病原体检测的灵敏度分别为86.2%、94.1%、90.2%，特异度均≥95%；而传统方法灵敏度因靶标不同波动在20%～85%，特异度为97.3%。结果证明GPP、多重实时PCR和TAC均有很好的检测性能和临床表现，灵敏度高于传统方法。

2.7高通量测序 高通量测序又称为二代基因测序，是一种同时测序数千到数十亿个DNA片段的技术。目前已上市的高通量测序产品种类较多，使用最广泛的是Illumina系列测序检测板，如iSeq、MiSeq和MiniSeq等[14]。高通量测序(非靶向测序)覆盖范围最为广泛，不仅可以发现潜在病原体，还能检测致病菌的耐药性基因，甚至能检测到病原体在遗传基因上发生的突变[32]。因此，不仅能为患儿提供个体化的治疗方案，也可为进一步研究提供更多的基因序列数据[33-34]。然而，该测序在儿童感染性腹泻病原体检测中不宜作为首选，因为其易受人类、肠道菌群和食物等干扰基因的影响，要求参考更多的基因序列数据[14,33-34]。同时，高通量测序价格较昂贵，需要平台建设和生物信息学团队的支持，因此更多用于一些病因不明确、培养较困难的病原体(如艰难梭菌等)检测或病原体基因研究中[13,27]。

综上所述，临床上被广泛应用的商业化检测系统的性能比较见表1。

表1 各腹泻病原体检测系统的性能比较

3 小 结

相对于传统检测方法，新型分子诊断方法在病原体种类覆盖度、检测耗时、灵敏性、自动化程度、远期医疗负担等方面均具有独到的优势。随着分子生物技术的不断发展，分子诊断技术成本也将不断降低，儿童感染性腹泻病有望实现快速、全面、高灵敏度、高特异度、低成本的检测，从而早期明确导致腹泻的病原体，指导临床合理用药，预防病原体传播，降低医疗费用。