MaReCs技术在胚胎植入前染色体结构异常遗传学检测周期中的应用研究*

袁振亚，袁 牧，黄晓洁

(徐州市妇幼保健院生殖医学中心，江苏 徐州 221009)

平衡易位是一种较常见的染色体结构畸变，在一般人群中发生率约为0.2%[1-3]。罗伯逊易位又称为罗氏易位，是平衡易位的一种特殊形式。平衡易位患者产生异常配子的概率很高，可能导致不孕、胚胎停止发育、反复妊娠丢失、出生缺陷等一系列生殖或遗传问题，给患者家庭和社会带来痛苦和负担[4]。胚胎植入前染色体结构异常遗传学检测(PGT-SR)技术可筛选出整倍体胚胎进行移植，有效解决了平衡易位患者的生育困扰。然而，常规PGT-SR无法识别胚胎是否携带易位染色体，因而无法阻断染色体易位在家族中的传递[5]。等位基因映射识别胚胎易位染色体携带状态(MaReCs)技术，可精准鉴别平衡易位患者PGT-SR周期获得的整倍体胚胎是否携带易位染色体，彻底阻断染色体易位向后代传递[6-7]。本研究探讨了MaReCs检测在PGT-SR周期中应用的临床价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2019年1月至2021年9月本中心平衡易位和罗氏易位患者49例，共有49个PGT-SR周期，其中罗氏易位17个周期，纳入罗氏易位组(RobT组，17例)；平衡易位32个周期，纳入平衡易位组(RecT组，32例)。将RecT组中成功进行MaReCs检测和成功构建单体型但因没有整倍体胚胎而无法进行MaReCs检测的患者进一步分为RecT_T亚组和RecT_F亚组。纳入标准：(1)患者及配偶有一方明确诊断为平衡易位，且另一方染色体核型无明显异常(320～400条带，G显色)；(2)患者及配偶已签署相关知情同意书，已在本中心接受PGT-SR技术治疗；(3)同意接受采用MaReCs检测识别整倍体胚胎是否携带易位染色体。排除标准：(1)任何一方患有严重精神疾患、泌尿生殖系统急性感染、性传播疾病；(2)患有《母婴保健法》规定的不宜生育的疾病；(3)任何一方具有吸毒等严重不良嗜好；(4)任何一方接触致畸量的射线、毒物、药品并处于作用期；(5)其他不适于进行PGT-SR或MaReCs检测的情况。所有患者在接受PGT-SR和MaReCs检测前均接受了详细、充分的遗传咨询。本研究获得了院生殖医学伦理委员会批准。2组一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 2组女性患者一般资料比较

组别nP(ng/mL)LH(mIU/mL)AMH(ng/mL)AFC(个)RobT组170.41±0.174.73±1.794.99±4.3515.82±5.75RecT组320.55±0.494.33±2.473.91±2.6115.09±6.04

1.2仪器与试剂 体外受精：工作站(PICB-130，上海品济公司)；倒置显微镜(Stemi 508，德国ZEISS公司)；显微操作系统(MTK-1，日本NARISHIGE公司)；显微注射针(K-MPIP-3330，美国COOK Medical公司)；持卵针(K-HPIP-1030，美国COOK Medical公司)。胚胎培养：胚胎培养液(G-TL，瑞典Vitrolife公司)；时差培养系统(EmbryoScope+，瑞典Vitrolife公司)。囊胚活检：活检针(SBB-20Z-30,美国Sunlight Meidical公司)；持卵针(型号：K-HPIP-1030，美国COOK Medical公司)。囊胚玻璃化冷冻与解冻：玻璃化冷冻液(VT101，日本Kitazato公司)；玻璃化解冻液(VT102，日本Kitazato公司)。MaReCs检测：活检样本保存液(型号：XK-043，美国Illumina公司)；基因测序通用样本处理试剂盒(XK-028-24，美国Illumina公司)；基因测序文库试剂盒(XK-038-48，美国Illumina公司)；测序反应通用试剂盒(XK-034，美国Illumina公司)；SNP位点引物试剂盒(KT10080，Illumina，美国)；Miseq测序仪(美国Illumina公司)。

1.3方法

1.3.1控制性超促排卵 采用长方案或拮抗剂方案对患者进行控制性超促排卵，最大卵泡直径18 mm及以上或有2个卵泡直径以上达到16 mm即为扳机日。在B超引导下行阴道穿刺取卵。

1.3.2体外受精与胚胎培养 对患者均行卵胞浆内单精子显微注射(ICSI)术完成授精，使用G-TL培养液和时差培养系统进行胚胎培养和形态学观察。

1.3.3囊胚活检 在培养至5～6 d后(受精日为第0天)发育成囊胚，对囊胚进行形态学评级(参照Gardner囊胚分级标准)，对评级为4CB或4BC以上囊胚进行活检。囊胚活检采用机械法和激光法结合的方式，活检3～10个囊胚外滋养层细胞，不损伤囊胚内的细胞团，活检细胞样本严格按编号装入含有细胞裂解液的收集管中用于PGT-SR检测。活检后的囊胚严格按编号进行玻璃化冷冻。

1.3.4识别囊胚易位携带状态 基于下一代测序(NGS)的PGT-SR检测可帮助筛选出整倍体囊胚(分辨率4 Mb)。采用多次退火环状循环扩增技术，对活检样本进行单细胞全基因组扩增，构建文库后上机测序，通过MaReCs检测，根据NGS信息寻找易位染色体断裂点上下游单核苷酸多态性(SNP)位点，构建易位染色体的SNP单倍体分型特征。将胚胎染色体SNP单体型和易位染色体SNP单体型进行比较，可鉴别胚胎是否携带亲本的易位染色体。

1.3.5移植与随访 PGT-SR与MaReCs检测结果明确有可移植囊胚后，做好人工周期的内膜准备，将不携带易位染色体的整倍体囊胚解冻复苏，完成移植。如果本周期仅有携带的囊胚，患者需要接受充分的遗传咨询后再决定是否进行移植。所有周期均采用单囊胚移植。移植后14 d检测血人绒毛膜促性腺激素(>20 mIU/mL)、移植后28 d B超下可见孕囊即为临床妊娠。妊娠16～20周进行羊水穿刺术，分析胎儿的染色体整倍性及核型，判断产前诊断结果与PGT-SR和MaReCs检测结果是否一致。

1.3.6观察指标 D0获卵总数、第二次减数分裂中期(MⅡ)卵数、MⅡ卵率(MⅡ卵数/D0获卵总数×100%)、双原核受精卵(2PN)数、2PN受精率(2PN数/MⅡ卵数×100%)、2PN卵裂数、2PN卵裂率(2PN卵裂数/2PN数×100%)、D3优质胚胎数、形成囊胚数、囊胚形成率(囊胚形成数/培养囊胚数×100%)、可活检囊胚形成数、可活检囊胚形成率(可活检囊胚形成数/培养囊胚数×100%)、整倍体率(整倍体数/成功检测囊胚数×100%)、非整倍体率(非整倍体数/成功检测囊胚数×100%)、嵌合体率(嵌合体数/成功检测囊胚数×100%)、胚胎易位染色体携带率(携带易位胚胎数/整倍体胚胎数×100%)、SNP单体型构建成功率(SNP单体型构建成功周期数/要求进行MaReCs周期数×100%)。

2 结 果

2.1RobT组与RecT组胚胎培养情况比较 2组均进行了ICSI周期和全囊胚培养。2组获卵总数、MⅡ卵数、MⅡ卵率、2PN数、2PN率、2PN卵裂数、2PN卵裂率、D3优质胚胎数、形成囊胚数、囊胚形成率、可活检囊胚形成数、可活检囊胚形成率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 RobT组与RecT组胚胎培养情况比较

组别n2PN卵裂率(%)D3优质胚胎数(枚)形成囊胚数(枚)囊胚形成率(%)可活检囊胚形成数(枚)可活检囊胚形成率(%)RobT组17100.00±0.005.59±5.006.12±4.7376.15±16.965.00±4.4660.97±25.63RecT组3299.65±1.445.25±3.645.03±2.9767.52±24.493.75±2.5450.95±24.60

2.2RobT组与RecT组PGT-SR与MaReCs检测结果比较 RobT组中，12例要求进行MaReCs检测，其中11例成功进行了MaReCs检测。RecT组中，23例要求进行MaReCs检测，其中12例成功进行了MaReCs检测。见表3。

表3 RobT组与RecT组PGT-SR与MaReCs检测结果比较

组别n要求MaReCs检测(n)MaReCs检测成功检测(n)整倍体率[%(n/n)]胚胎易位染色体携带率[%(n/n)]SNP单体型构建成功率[%(n/n)]RobT组17121171.21(47/66)53.19(25/47)91.67(11/12)RecT组32231234.38(22/64)45.45(10/22)95.65(22/23)

2.3RecT_T亚组与RecT_F亚组相关指标比较 在RecT组中，成功进行MaReCs检测的患者(12例)和成功构建单体型但因没有整倍体胚胎而无法进行MaReCs检测的患者(10例)共22例，进一步分为RecT_T亚组(12例)和RecT_F亚组(10例)。2亚组年龄、AMH、AFC及D0获卵总数比较，差异无统计学意义(P>0.05)，但形成囊胚数及活检囊胚数比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 RecT_T亚组与RecT_F亚组相关指标比较

2.4RobT组与RecT组移植结局分析 RobT组中，2例仅有携带易位染色体囊胚的患者接受遗传咨询后决定进行下一周期。9例MaReCs周期患者均移植了不携带亲本易位染色体的整倍体囊胚并成功受孕。羊水穿刺样本染色体核型分析、染色体芯片检测结果与PGT-SR和MaReCs检测结果一致。其中，8例顺利分娩，1例妊娠。RecT组中，2例仅有携带易位染色体囊胚的患者接受遗传咨询后决定进行下一周期。10例MaReCs周期患者均移植了不携带亲本易位染色体的整倍体囊胚并成功受孕。羊水穿刺样本染色体核型分析、染色体芯片检测结果与PGT-SR和MaReCs检测结果一致。其中，9例顺利分娩，1例流产。

3 讨 论

染色体平衡易位可产生染色体不平衡胚胎，导致不孕、胚胎停止发育、反复妊娠丢失、出生缺陷患儿等。为使平衡易位患者的后代不再遭受染色体易位导致的生育压力，彻底阻断易位染色体在家族中的传递，则须实现在孕前对胚胎同时进行染色体整倍性筛查及易位携带状态的检测。目前，广泛应用的基因芯片技术及二代测序技术可检测出胚胎染色体的拷贝数变异情况，却无法识别其易位携带状态。荧光原位杂交技术可以诊断复杂的染色体易位，但对单个细胞检测效果欠佳[8-11]。染色体显微切割技术也可明确易位断裂位点信息，结合二代测序技术识别胚胎染色体易位携带状态，但该技术操作复杂，需要高度专业的设备和熟练的操作技能，不适于在临床上广泛应用[12]。

构建易位染色体SNP单体型是成功识别胚胎易位携带状态的关键。由于罗氏易位和平衡易位患者产生平衡配子的机会有差异，患者夫妇通过1次促排卵周期能够获得整倍体胚胎、成功完成胚胎易位携带状态识别的概率也存在差异。前期研究发现，约有50%的平衡易位与罗氏易位患者在首个PGT-SR周期可成功进行MaReCs检测[13]。本研究结果显示，12例要求MaReCs检测的罗氏易位患者中，11例获得整倍体胚胎并成功完成MaReCs检测(完成率为91.67%)；23例要求MaReCs检测的平衡易位患者中，12例获得整倍体胚胎并成功完成MaReCs检测(完成率为52.17%)。本研究结果显示，采取灵活、高效的临床策略，结合MaReCs技术，罗氏易位与平衡易位患者在首个促排卵周期分别有91.67%和95.65%的单体型构建成功率[14-16]。如果本周期或下一周期获得整倍体胚胎，即可进行MaReCs检测，识别胚胎的易位染色体携带状态。首次促排卵没有成功构建单体型的患者往往有2个特征：一是活检胚胎数少；二是无法通过亲本获取用于构建单体型的NGS信息。对这类患者，应继续进行促排卵周期，获得更多与易位异常相关的信息，帮助构建易位染色体SNP单体型，完成MaReCs检测。

综上所述，MaReCs检测是一种高效、灵活的识别胚胎易位染色体携带状态的方法，可彻底阻断易位染色体在家族中的传递。平衡易位患者往往比罗氏易位患者拥有更强烈的区分携带的意愿，不希望子代继续面临易位带来的生育风险。MaReCs检测是一项灵活、高效区分胚胎易位携带状态的技术，在保证医疗安全的情况下，应充分考虑患者的实际情况，采用灵活高效的临床策略，运用MaReCs检测阻断染色体易位向后代传递，降低生育风险，减轻人类遗传负荷，提高人口素质。