白藜芦醇调控SIRT1改善高脂小鼠肾损伤的作用及机制研究

许 伶，卢佳佳，储 晨

(1.合肥职业技术学院基础医学科，安徽合肥 238000；2.安徽医科大学附属巢湖医院)

近年来，人们的生活方式发生了巨大变化，不规律饮食及不良生活习惯加重，导致高脂人群数量逐年上升。高脂人群的常见特征是脂质代谢紊乱，机体脂质异常代谢，肾小球糖原大量沉积，诱导肾组织细胞产生脂质毒性，引发肾小管纤维化，最终使得肾脏功能结构发生变化，进而造成严重的肾损伤[1]。

哺乳动物体内普遍存在的沉默信息调节因子相关酶1(Sirtuin 1, SIRT1)，是依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的去乙酰化修饰酶，参与了细胞多种生理活动，影响了细胞的代谢和凋亡[2]。SIRT1可通过调控机体内PGC-1α、NF-κB等重要的转录因子，调节组织细胞产生氧化应激反应和增殖，从而达到保护组织细胞的作用[3]。白藜芦醇(Resveratrol, RSV)具有抗氧化、抗炎、抑制细胞凋亡的药理作用，对肾脏具有一定保护作用。有研究报道，RSV主要是通过激活SIRT1相关信号通路，使得细胞清除自由基，抗氧能力增强，以此减轻肾脏损伤[4]。但目前RSV对于肾脏保护的作用机制尚未明确。本文主要探究RSV介导SIRT1改善高脂小鼠肾损伤的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 选取SPF级C57BL/6J小鼠30只，小鼠周龄为6周，体质量为18～20 g，由安徽医科大学实验动物中心提供，置于IVC型独立送风隔离笼内进行饲养。

1.2仪器 全自动生化仪(AU480, Beckman Coulter公司)，光学显微镜(CX31, OLYMPUS公司)，石蜡切片机(RM2135, LEICA公司)，实时荧光定量PCR仪(MA-6000, 苏州雅睿生物技术有限公司)。

1.3试剂 RSV (南京泽朗植提技术有限公司)；高脂饲料(主要配方为59 %维持料、20 %蔗糖、10 %蛋黄粉、10 %猪油、1 %胆固醇，由协同生物公司提供)；肌酐ELISA试剂盒(Abcam公司)；多聚甲醛、PBS、显影液、定影液、PVDF膜(Servicebio公司)；苏木素(MedChemExpress公司)；伊红(北京华迈科生物技术有限公司)；RIPA、PMSF(上海博湖生物科技有限公司)；BCA试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)；FN、SIRT1、GPx4、SOD2、GAPDH抗体(Abcam公司)；生物素-链霉卵白素免疫组化检测试剂盒、羊抗兔IgG、浓缩型DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；反转录试剂盒(TaKaRa公司)。

1.4方法

1.4.1造模及给药 将小鼠适应性喂养5 d后，采用随机数字表法将其分为对照组(CTRL组)、高脂组(HL组)、白藜芦醇组(RSV组)三组，各10只，构建高脂小鼠模型。HL组与RSV组小鼠均给予高脂饲料喂养，RSV组小鼠给予高脂饲料的同时以RSV 5 mg/(kg·d) 进行灌胃，CTRL组给予普通饲料，持续18周。

1.4.2血脂、肌酐水平检测 实验结束后，取三组小鼠的血液，采用血液全自动生化仪检测血浆中甘油三酯(Triglyceride, TG)、总胆固醇(Total cholesterol, TC)、低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein, LDL-C)的水平，采用ELISA检测试剂盒测定血清中肌酐(Creatinine， CRE)水平。

1.4.3肾组织形态学观察 在取血结束后，将小鼠脱颈处死，清理腹部毛发，使用手术剪刀沿腹中线剪开，暴露肾脏，取出肾脏，并于多聚甲醛中固定24 h；固定完成后取出肾组织，采用梯度乙醇和二甲苯对组织进行脱水、透明；随后将组织浸蜡，包埋，制作成石蜡标本；石蜡标本采用石蜡切片机制备成厚度5 μm的石蜡切片；对切片进行脱蜡、水化、分化、苏木素-伊红染色、脱水透明、封片后利用光学显微镜观察肾脏组织形态学的变化。

1.4.4纤维粘连蛋白组化染色 如1.4.3所述制备肾组织5 μm的石蜡切片，将切片进行脱蜡、水化后，滴加过氧化氢以降低内源性过氧化酶活性，浸入抗原修复液中加热至微沸后冷却，重复3次，血清封闭，滴加一抗纤维粘连蛋白(Fibronectin, FN)(1∶200)，置入湿盒内4 ℃过夜，PBS洗片，滴加羊抗兔IgG 37 ℃孵育30 min，PBS洗片，加入辣根酶的链霉抗生物素蛋白37 ℃孵育30 min，滴加DAB显色，采用纯净水终止显色，苏木精染核10 min后进行脱水、透明、封片，封片后利用显微镜观察肾脏FN表达情况。

1.4.5SIRT1及抗氧化蛋白免疫印迹 (1)提取蛋白：取50 mg肾组织加入RIPA和PMSF抑制剂于匀浆器中进行裂解，匀浆物以12 000 r/min离心，取含蛋白质的上清液备用；(2)BCA定量：制作蛋白浓度标准曲线，按照BCA法测定肾组织蛋白，计算肾组织蛋白的浓度；(3)配制凝胶：根据目标蛋白质的分子量，配制合适浓度分离胶和浓缩胶；(4)电泳、转膜、抗体孵育：取适量的蛋白样品上样，连接电源，进行电泳，采用聚偏二氟乙烯(PVDF)膜转模，5 %脱脂牛奶封闭液封闭1 h，一抗SIRT1(1∶2 000)，GPx4(1∶2 000)，SOD2(1∶2 000)，以GAPDH(1∶2 000)为内参，4 ℃孵育过夜，孵育过夜后用PBS缓冲液洗膜，后加入二抗孵育1 h；(5)显影、定影、分析：在暗室中将PVDF膜分别浸入显影液和定影液中，根据信号的强弱适当调整曝光时间进行曝光显影，待出现明显条带后，即刻终止显影，扫描拍照，用凝胶图像处理系统分析其光密度值。

1.4.6SIRT1及抗氧化基因的测定 取50 mg肾脏组织，采用Trizol法提取肾组织总RNA；检测RNA的纯度及浓度达到要求后，采用反转录试剂盒对所提取的总RNA反转录为cDNA，进行逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain, RT-PCR)实验，20 μL反应体系，利用公式F=2-△△Ct计算相关SIRT1、Gpx4、MnSOD的相对表达量。引物序列见表1。

表1 RT-PCR引物序列

2 结果

2.1三组血脂、肌酐水平比较 血脂测定结果显示，CTRL组小鼠的TG、TC、LDL-C水平均正常；HL组小鼠的TG、TC、LDL-C水平与CTRL组相比均有升高(P<0.05)；RSV组小鼠的TG、TC、LDL-C水平与HL组相比均有下降(P<0.05)。HL组小鼠的CRE水平与CTRL组相比升高(P<0.05)，RSV组小鼠CRE的水平与HL组相比降低(P<0.05)。

表2 三组血脂、肌酐水平比较

2.2肾组织形态学变化 根据染色结果显示，CTRL组小鼠肾脏形态结构完整，未见异常病理变化；HL组小鼠肾脏组织产生炎性浸润，细胞间质增加，可见肾小管发生严重纤维化，肾小球组织细胞弥漫性增生、系膜增多肿胀、基质空泡变性；RSV组小鼠较HL组肾组织炎性浸润区域和细胞间质减少，肾小管纤维化程度降低，肾小球组织增生面积减小，系膜肿胀及基质空泡样变化明显减轻。见图1。

2.3肾组织FN表达 根据FN染色结果显示，CTRL组小鼠肾组织中FN表达呈黄棕色，表达的部位主要集中在细胞间质，HL组小鼠肾组织FN阳性表达较CTRL组增多，RSV组小鼠肾组织FN阳性表达较HL组显著下降。见图2。

图1 各组小鼠肾组织形态学变化(×200)

图2 各组小鼠免疫组化染色(×400)

2.4SIRT1及抗氧化蛋白表达 根据免疫印迹显色结果进行统计分析，CTRL组小鼠肾组织中SIRT1及抗氧化蛋白GPx4、SOD2表达情况正常，HL组小鼠肾组织中SIRT1及抗氧化蛋白GPx4、SOD2表达较CTRL组显著减少(P<0.05)，RSV组小鼠在给予RSV干预后肾组织SIRT1及抗氧化蛋白GPx4、SOD2表达增加(P<0.05)。见图3。

2.5SIRT1及抗氧化基因表达 根据RT-PCR结果进行分析，与CTRL组相比，HL组小鼠肾组织中SIRT1、GPx4、SOD2 mRNA表达显著降低(P<0.05)，与HL组相比，RSV组小鼠肾组织SIRT1、GPx4、SOD2 mRNA表达显著增加(P<0.05)。见图4。

图3 各组小鼠肾组织中SIRT1、GPx4和SOD2蛋白的表达

图4 各组小鼠肾组织中SIRT1、GPx4和SOD2基因的表达

3 讨论

由高脂饮食引发的肥胖，经长期的脂质代谢异常，诱导肾脏组织内脂质堆积，导致肾脏损伤，引发肾功能结构发生变化，最终形成慢性肾病[5]。SIRT1是sirtuin家族成员之一，其广泛存在于肾脏中。相关研究表明，SIRT1可以通过抑制氧化应激反应来减缓慢性肾损伤的发展[6]。在抑制氧化应激反应中，肾组织中的抗氧化酶作用关键，其中GPx4与SOD起主导作用。抗氧化酶SOD2使氧化应激期间产生的超氧化物自由基歧化，而GPx4是一种有助于去除H2O2的同工酶，两种酶均催化了抗氧化途径的必要步骤[7]。大量的研究证实，RSV作为一种抗氧化剂，可以预防高尿酸血症、糖尿病肾病和药物诱导的肾损伤，其还是SIRT1的激活剂，主要是通过降低乙酰化底物的Km值，提高SIRT1的活性，发挥抗氧化的药理作用[8]。

SIRT1是一种依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的组蛋白去乙酰酶，参与细胞的分化、增殖、凋亡等重要生命活动过程，可通过调控抗氧化酶的活性调节细胞内的脂质代谢。脂质代谢异常，使得细胞内活性氧水平升高，从而诱导氧化应激反应，最终导致肾内皮细胞严重损伤。SIRT1的激活可以增加抗氧化酶的活性，降低活性氧水平，抑制机体氧化应激反应。本研究通过长期喂养高脂饲料构建高脂小鼠肾损伤模型，给予RSV干预治疗，探究RSV对于高脂小鼠肾损伤的保护作用。研究结果提示RSV显著降低了TG、TC、LDL-C及CRE的水平，肾组织形态得到有效改善，SIRT1及抗氧化酶GPx4、SOD2活性及其基因表达增加，表明RSV改善了脂质代谢异常，通过激活SIRT1相关信号通路，增加抗氧化酶的活性，抑制了肾功能损伤。

综上所述，RSV通过调控SIRT1通路促进了抗氧化途径的活化，抗氧化酶的表达提高，抑制了肾组织氧化应激反应，使得高脂诱导的肾功能损伤得到改善，对肾脏发挥了良好的保护和预防作用，为临床上预防治疗高脂诱导的肾损伤提供参考。