RS3PE综合征患者血清MMP-3、TIMP1/2、SPP1和PLG表达水平及其相关性研究*

于江锐，闫慧明

(1.内蒙古科技大学包头医学院研究生学院，内蒙古包头 014040；2.内蒙古科技大学包头医学院第二附属医院)

缓解性血清阴性对称性滑膜炎伴凹陷性水肿(Remissive seronegative symmetric synovitis with depressed edema,RS3PE)是一种罕见的风湿病，其特征为急性发作对称性滑膜炎、手背点状水肿、类风湿因子(Rheumatoid factor,RF)阴性以及对小剂量糖皮质激素效果显著，往往影响≥50岁的患者[1-2]。RS3PE的确切患病率目前仍不清楚。RS3PE与多种肿瘤和炎症性疾病相关，通常可作为这些疾病的初始表现。来自合并病例报告的数据估计，RS3PE相关恶性肿瘤的全球发病率为20.0 %,实体瘤比血液系统恶性肿瘤更普遍，占相关RS3PE病例的75.0 %[3]。胃肠道和泌尿生殖系统恶性肿瘤更常见，腺癌是最常见的肿瘤[4]。大多数与RS3PE相关的恶性肿瘤将在RS3PE最初诊断后的4年内检测到。因此，对于RS3PE的早期诊断和筛查对预防肿瘤非常必要。

基质金属蛋白酶3(matrix metallopro-teinase-3,MMP-3)是一种由滑膜细胞、软骨细胞和成纤维细胞在炎性细胞因子和氧化应激作用下产生的蛋白酶。RS3PE综合征会导致滑膜炎症并上调MMP-3的表达，使血清MMP-3水平升高[5]，因此检测患者血清MMP-3水平可能支持诊断并反映疾病状态，且比CRP更敏感[6]。MMP-3已知在乳腺癌、胃癌、结直肠癌、肺癌和基底细胞癌中产生。因此，如果在RS3PE综合征中MMP-3水平升高，则必须考虑与恶性肿瘤相关的并发症。患者发病后2～3年内常伴有恶性肿瘤[7]。血清高水平的MMP-3是RS3PE综合征合并恶性肿瘤的有意义的生物标志物[8]。因此，寻找与MMP-3类似的生物标记物对RS3PE的早期筛查尤为关键。本研究以生物信息学数据库为基础，进行了RS3PE靶点预测，并进一步对MMP-3相关蛋白互作靶点进行了预测。随后结合RS3PE临床病例，检测了患者血清中相关靶点的表达变化，并与RS3PE疾病活动度相关指标血沉(erythrocyte sedimentation rate,ESR)和CRP做了相关性分析，为临床筛选RS3PE生物标记物提供了重要参考。

1 对象与方法

1.1对象 收集2020年5月～2021年7月包头医学院第二附属医院风湿免疫科诊治的RS3PE综合征患者21例为RS3PE组,选择与其年龄相匹配的健康体检者30例作为对照组(CON组)。观察指标包括：RF、ESR、CRP、X线表现、磁共振成像(MRI)表现。

根据McCarty等[9]提出的诊断标准作为纳入标准：(1)起病急；(2)多老年起病；(3)多关节炎双侧对称并伴有肢端的可凹陷性水肿；(4)关节炎为非侵蚀性；(5)血清类风湿因子呈阴性；(6)应用糖皮质激素治疗效果佳。排除标准：排除合并有严重感染、心血管疾病、内分泌系统相关疾病、血液系统疾病、肾脏疾病或其他代谢性疾病、炎性肠病者及合并其他结缔组织病者；排除长久口服抗风湿药物(DMARDs)、激素者。标本收集：患者和健康对照者早晨空腹抽取5 mL静脉血，离心后吸取血清于EP管中，放置于-80 ℃冰箱中待检。qRT-PCR及ELISA检测的具体实验操作按照试剂盒说明书进行。本研究受试者均知情同意并经医院伦理委员会批准通过。

1.2方法 RS3PE的疾病靶点预测在Genecard数据库(https://www.genecards.org/)中以“RS3PE”为检索词，获取RS3PE的相关靶点。

MMP-3相关靶点蛋白互作网络构建：在string-db数据库(https://string-db.org/)和genemania数据库(http://genemania.org/)中以“MMP-3”为检索词，获取RS3PE的相关靶点蛋白互作网络图；通过Venny软件对string-db数据库和genemania数据库检测的MMP-3相关靶点蛋白取交集，明确MMP-3关键相关靶点。

2 结果

2.1RS3PE的疾病靶点预测 通过Genecard数据库预测RS3PE的疾病靶点有2个，分别为MMP-3和CRP。见图1。

图1 RS3PE的疾病靶点预测图

2.2MMP-3相关靶点预测 通过string-db数据库预测MMP-3相关靶点有11个，通过genemania数据库预测MMP-3相关靶点有21个，两个数据库通过Venny软件取交集，有共同靶点5个，分别为MMP-3、基质金属蛋白酶抑制剂1(tissue inhibitor of metalloproteinases-1，TIMP1)、基质金属蛋白酶抑制剂2(tissue inhibitor of metalloproteinases-2，TIMP2)、血清骨桥素1(serum bone bridging protein 1，SPP1)及纤溶酶原(plasminogen，PLG)。见图2。

图2 string-db数据库和genemania数据库交集图

2.3两组患者基本临床特点比较 与CON组相比，RS3PE组ESR、CRP水平均升高(P<0.05)；而两组间年龄和RF差异无统计学意义(P>0.05)。见表1，图3。

表1 两组患者临床特点比较

图3 两组患者ESR、CRP、RF水平比较图

2.4两组患者各因子基因水平结果 与CON组相比，RS3PE组MMP-3、TIMP1、TIMP2、SPP1 mRNA水平均升高(P<0.05)；而PLG mRNA水平两组间差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 两组患者各因子基因水平比较

2.5两组患者各因子水平结果 与CON组相比，RS3PE组MMP-3、TIMP1、TIMP2、SPP1水平均升高(P<0.05)；而两组间PLG水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表3，图4。

表3 两组患者各因子水平比较

图4 两组患者MMP-3、TIMP1、TIMP2、SPP1/PLG水平比较图

2.6MMP-3、TIMP1、TIMP2、SPP1水平与ESR、CRP相关性分析 结果显示：MMP-3、TIMP1、TIMP2、SPP1水平与ESR、CRP均呈明显正相关。见表4，图5，图6。

图5 MMP-3、TIMP1、TIMP2、SPP1水平与ESR相关性分析图

图6 MMP-3、TIMP1、TIMP2、SPP1水平与CRP相关性分析图

表4 RS3PE患者血清中MMP-3、SPP1、TIMP1、TIMP2含量与ESR、CRP的相关性分析[r(P)]

3 讨论

McCarty等[9-13]于1985年首次描述了RS3PE综合征。有报道指出，RS3PE常合并恶性肿瘤。因此对RS3PE早期诊断、筛查对预防肿瘤的发生具有重要意义。为了探究RS3PE患者血清中MMP-3变化规律，筛选出有价值的能够反映疾病状态的标志物，本研究首先对RS3PE的靶点进行了预测。结果发现，Genecard数据库预测RS3PE的疾病靶点共有2个，分别为MMP-3和CRP。这与之前的研究结果一致。本研究对21例RS3PE患者进行了血清ESR及CRP检测，结果显示二者水平均明显高于CON组。众所周知，MMPs是一个参与肿瘤侵袭的蛋白水解酶家族，该家族的几个成员已被证明与肿瘤预后相关[14]。据报道，大肠癌患者血清中MMP-3和MMP-9表达增加[15]。MMP-3水平升高也见于一些泌尿系统肿瘤、乳腺癌、基底细胞癌[16]。这些数据表明，MMP-3水平的升高可能与实体癌的进展或浸润有关。RS3PE患者血清MMP-3显著升高可能反映了癌组织和滑膜组织原位产生MMP-3，相对较高的CRP和ESR水平可能也与MMP-3有关。

大量数据文献及本研究已经证实MMP-3在RS3PE患者中的应用价值，深度挖掘与MMP-3相关的蛋白靶点，对指导临床具有重要价值。本研究对21例RS3PE患者血清MMP-3基因和蛋白水平与ESR和CRP水平进行了相关性分析，结果显示，MMP-3水平与ESR和CRP水平呈明显正相关，这提示MMP-3可反映疾病的活动度。本研究又进一步应用生物信息学方法通过string-db数据库预测MMP-3相关靶点有11个，通过genemania数据库预测MMP-3相关靶点有21个。对两个数据库通过Venny软件取交集，有共同靶点5个，分别为MMP-3、TIMP1、TIMP2、SPP1、PLG。基于以上结果，本研究利用ELISA检测了21例RS3PE患者及30例健康对照组的MMP-3、TIMP1、TIMP2、SPP1、PLG水平。结果发现，RS3PE组MMP-3、TIMP1、TIMP2、SPP1水平明显升高，而PLG水平无明显变化，提示TIMP1、TIMP2、SPP1水平与MMP-3水平关系密切，可能在RS3PE患者疾病发展中扮演重要的角色。

TIMPs为MMPs的特异性阻断剂，由胱氨酸和色脯氨酸残基形成高度紧密的三级结构，其氨基酸末端的半胱氨酸残基与活化的MMP按照1∶1结合成MMP-TIMP复合物，进而抑制MMPs的酶活性以及细胞增殖，阻断其与作用底物相结合[17]。当MMPs活性明显高于TIMPs时，破坏MMPs/TIMPs平衡，会引起软骨受损。TIMP-1和TIMP-2表达于巨噬细胞和结缔组织，大多数细胞因子能刺激其表达，这其中包括活化的MMP-3和MMP-9，同时亦可对RA滑膜血管侵袭起到阻断效果[18]。有文献报道，通过对SCID鼠进行TIMP-1和TIMP-2转染，可引起RA的侵袭力与增殖下降，提示TIMP不但能抑制MMPs，还能使滑膜细胞等组织的功能受到抑制[19]。活动期RA患者血清MMP-3、TIMP-1、TIMP-2水平明显升高，MMP-3/TIMP-1/TIMP-2失衡可能对RA的发展进程影响重大。MMP-3/TIMP-1/TIMP-2失衡会导致滑膜巨噬细胞及嗜酸性粒细胞的浸润，这可加剧RA损伤[20]。文献发现，活动期RA患者血清MMP-3升高程度大于TIMP-1，TIMP-1不能显著抑制MMP-3的活性，其比例失衡促进了关节软骨的降解，所以MMP-3/TIMP-1较正常组升高，表明MMP-3/TIMP-1在RA发病中起关键作用[21]。以上报道提示TIMP-1、TIMP-2在RA中表达水平改变与RA发生发展关系密切，而有学者认为RS3PE为RA的一种特殊类型，这也间接说明TIMP-1、TIMP-2可能在RS3PE发展进程中具有重要意义。本研究发现，与对照组相比，RS3PE患者TIMP-1、TIMP-2水平明显增加，且与ESR和CRP水平呈明显正相关，验证了本研究的假设。

SPP1是最近发现由成骨细胞、巨噬细胞等多种细胞产生的与细胞外基质蛋白同源的促炎症细胞因子，在细胞表面与其受体结合诱导细胞信号转导，促进细胞的黏附和迁移，在细胞免疫过程中发挥重要调节作用[22]。研究表明，成骨细胞、破骨细胞可在SPP1的调控下导致骨代谢改变。SPP1浓度在绝经后妇女骨质疏松、RA继发骨质疏松患者中明显升高，提示SPP1作为骨代谢指标，可能参与了骨质疏松并发症的发生[23-24]。本研究发现，与对照组相比，RS3PE患者SPP1水平明显增加，且与ESR和CRP水平呈明显正相关，这提示SPP1可能参与了RS3PE的发展，具体机制有待进一步探讨。

总之，本研究通过生物信息学预测了RS3PE的相关靶点蛋白的表达及探讨了与RS3PE疾病活动相关指标的相关性，证实了MMP-3、TIMP1、TIMP2、SPP1四种因子的表达变化与RS3PE的发展密切相关。但是由于本研究样本量的限制，其具体作用机制尚未完全阐明，还需要更进一步的研究。RS3PE患者PLG水平与对照组比较差异无统计学意义，可能是由于样本量小的限制或病程等因素的影响，在后续研究的过程中会持续关注。