绳状青霉P-19不同固体发酵浸提液对马铃薯镰刀菌根腐病病原菌的抑制作用

姚 凡,王喜刚,郭成瑾,张丽荣,沈瑞清

(1.宁夏大学农学院,银川 750021;2.宁夏农林科学院植物保护研究所,银川 750002)

马铃薯是仅次于小麦、水稻、玉米的第四大粮食作物,具有耐寒、耐旱、耐瘠薄的特性,适应性广泛,可粮、菜、饲兼用,广泛种植于世界各地[1]。由于长期连作,使得由镰刀菌引起的马铃薯根腐病、干腐病、枯萎病等土传病害越来越严重,造成马铃薯生长发育不良,抗病能力降低[2]。这些病原菌侵染后使得马铃薯植株萎蔫,茎内维管束变褐,后期在病部表面产生白色菌丝,最终根部腐烂,大面积植株死亡,极难防治[3]。

目前对由镰刀菌引起的马铃薯土传病害尚未有很好的防治措施,国内外防治土传病害还是以化学防治为主[4],施用大量的农药不但对马铃薯土传病害防治效果不理想,而且会使病原菌产生抗药性,增加了防治难度,更重要的是造成环境污染和土壤结构改变。经大量学者研究,利用拮抗微生物控制作物根区土壤中病原菌的生长、繁殖,可以从源头上预防土传病害的发生,是一种符合微生态原理的有效办法。这种方法具有抗病促生的双重效果,不污染环境,对人体无害无毒,可以达到防治土传病害的目的[5-6]。

青霉Penicilliumspp.因生存能力强、抗菌谱广,对恶劣环境耐受性强,防病机制多,低毒无害,而被用于许多农作物和园林植物土传病害的预防和治疗[7]。自从弗莱明发现特异青霉P.notatum可产生抑制细菌生长的青霉素以来,已对该属的多种真菌进行了研究[8]。迄今为止,全球已有几十种青霉制剂在市场上出售。青霉是目前使用较多的生防菌,可以防治多种植物病原菌引起的病害,瓦克青霉P.waksmanii可以有效防治芒果炭疽病,实验室防效试验结果表明,瓦克青霉T-141可以将芒果炭疽病降低40%、病情指数减轻到10%[9]。Sindhu等[10]利用疣孢青霉P.verruculosum对甜瓜蔓枯病进行防治试验,研究表明,经过疣孢青霉处理过的甜瓜幼苗的株高、叶数、萌发率、根茎重、叶绿素含量等明显增高，可以有效防治甜瓜蔓枯病。杨利珍等[11-12]研究证明疣孢青霉具有抑菌广谱性,其对马铃薯干腐病菌Fusariumoxysporum的抑菌率达56.76%,对番茄灰霉病菌Botrytiscinerea的抑菌率达57.64%等。王德浩等[13]利用产紫青霉P.purpurogenum防治马铃薯黑痣病,产紫青霉菌Q2菌株可产生纤维素酶、蛋白酶、葡聚糖酶和生长素,具有解磷能力。研究表明,这类青霉菌不仅可以在大多数植物根系中定殖和生长,还可以促进根的生长,增加作物产量[14-16]。

中药渣含有大量微生物生长所需营养物质[17]本研究选取绳状青霉P-19作为供试菌株,以不同种类及配比的中药材边角料作为培养基主要成分进行固体发酵,并对浸提液抑菌效果进行评价,以期为青霉菌的开发和利用提供有益数据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 供试材料

绳状青霉PenicilliumfuniculosumP-19、木贼镰刀菌Fusariumequiseti、尖孢镰刀菌F.oxysporum、接骨木镰刀菌F.sambucinum、锐顶镰刀菌F.acuminatum和茄病镰刀菌F.solani均由宁夏农林科学院植物保护研究所提供。

甘草、板蓝根药渣和葡萄皮渣，均购于张掖市宏利中药材综合经营部。

1.2 试验方法

1.2.1菌株P-19对5种镰刀菌的拮抗活性

将P-19与镰刀菌分别接种于PDA平板,于25℃黑暗条件下培养5 d,用打孔器沿菌落边缘打取直径10 mm的菌饼,分别放在PDA平板中线上,两菌饼之间的距离大于20 mm,25℃黑暗条件下培养10 d左右,测定P-19对病原菌的拮抗能力。每个处理3次重复。

1.2.2碳、氮源的筛选及生物量的计算

以PDA培养基作为基础培养基进行碳氮源单因素试验,用等质量(2%)的小麦粉、玉米粉、马铃薯全粉、马铃薯淀粉、可溶性淀粉和麸皮粉为碳源,等质量(2%)的大豆粉、葡萄皮渣、硝酸铵、尿素、硫酸铵和硝酸钠为氮源。将各碳氮源分别添加到基础培养基中,配制成不同的碳源和氮源培养基,取经过活化直径为8 mm的菌饼作为接种体接入皿内,并且以不添加碳源和氮源基质作为对照,每个处理重复3次,用血球板计数法统计产孢量,同时用分光光度计在600 nm波长下测孢子悬浮液吸光值(OD),确定筛选效果。将培养好的菌丝体过滤,65℃烘干,称取生物量。

1.2.3菌株P-19的固体发酵

将煮后粉碎的甘草、板蓝根药渣及甘草+板蓝根+葡萄皮渣分别与粉碎的玉米、木屑以总质量40 g为标准按比例制成固体培养基,甘草药渣+玉米粉+木屑、板蓝根+玉米粉+木屑和甘草药渣、板蓝根药渣+玉米粉+木屑均按比例5∶4∶1、7∶2∶1、3∶5∶2配制;甘草+板蓝根+葡萄皮渣+玉米粉按比例2∶2∶10∶5、0∶2∶6∶4和2∶0∶6∶4分别加入250 mL三角瓶中,130℃高压灭菌60 min,分别接入P-19的种子液,于25℃下静置培养3 d,手工摇瓶后继续培养9～12 d,待菌丝长满培养基后取出,备用。

1.2.4菌株P-19的发酵产物对病原菌的抑制效果

取1 g发酵物烘干粉碎,加入2 mL无菌水充分摇匀,12 000 r/min离心10 min,将上清液过滤,取500 μL滤液滴于PDA培养基上,用无菌涂布棒涂布均匀,备用。用上述1.2.1的方法取病原菌菌饼,放入已涂布发酵产物的PDA平板中,25℃黑暗条件下培养5 d,不涂抹发酵产物设置为空白对照,9 d后测量菌落直径。考察发酵产物对5种镰刀菌的抑制效果。

菌落抑制率计算:取菌落互相垂直的两个直径分别读数,按照以下公式计算抑制率:抑制率=(S-S1)/S × 100%。其中:S表示PDA平板上病原菌菌落直径,S1表示在PDA培养基上涂布生防菌发酵产物后病原菌菌落直径。

1.2.5数据统计分析

采用Excel 2007对试验结果进行统计分析,DPS 17.10进行方差分析,用Duncan氏新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 菌株P-19与病原菌的对峙试验

表1结果表明,P-19对锐顶镰刀菌的抑制率最高,为64.32%,其次为接骨木镰刀菌和茄病镰刀菌,抑制率分别为45.07%和38.92%,对木贼镰刀菌的抑制率较低,为28.13%。

表1 绳状青霉P-19对5种马铃薯土传病害病原真菌的抑菌作用1)Table 1 Bacteriostatic effect of Penicillium funiculosum P-19 on five pathogenic fungi causing potato soil-borne diseases

2.2 菌株P-19培养基碳氮源筛选

2.2.1碳源对P-19生物量的影响

由表2可以看出,不同碳源条件下生防菌P-19生物量不同,其中当基础培养基PDA中碳源为麸皮时P-19生物量积累最高,为29.34 g/L,其次为玉米粉,生物量积累为23.58 g/L,相比之下,碳源为马铃薯淀粉和可溶性淀粉时,生物量很低。

2.2.2氮源对P-19生物量和发酵液pH的影响

分别选择P-19生物量高的麸皮和玉米粉作为碳源,与不同氮源组合对P-19进行培养,结果表明(表3),P-19液体发酵以玉米粉为碳源时,大豆粉为氮源的生物量的积累最大,为25.45 g/L,pH为5.88;当碳源为麸皮时,氮源为葡萄皮渣的发酵液中P-19的生物量最大,为23.97 g/L,pH为5.75;而以尿素为氮源时,在2种碳源条件下P-19的生物量均较小,为7.09～9.03 g/L,pH最大,在9.4以上。

表2 碳源对绳状青霉P-19生物量的影响Table 2 Effects of carbon sources on the biomass of Penicillium funiculosum P-19

2.3 不同中药水浸提物对P-19生物量的影响

由表4可见,在P-19最佳碳源和氮源的液体发酵培养基中加入35%甘草+35%板蓝根水提液可使菌体的最大生物量达到30.50 g/L,比对照增加19.84%。

表3 氮源对绳状青霉P-19生物量和其发酵液pH的影响Table 3 Effects of nitrogen sources on the biomass of Penicillium funiculosum P-19 and pH of its fermentation broth

表4 不同中药水提物对绳状青霉P-19发酵生物量的影响Table 4 Effects of different aqueous extracts of Chinese herbs on Penicillium funiculosum P-19 fermentation biomass

2.4 菌株P-19中药渣固态发酵培养基的筛选

表5综合考虑了P-19在含有甘草或板蓝根或葡萄皮渣的固体培养基的生长情况,筛选出甘草∶玉米粉∶木屑分别为5∶4∶1、7∶2∶1、3∶5∶2,板蓝根∶玉米粉∶木屑为3∶5∶2,甘草∶板蓝根∶葡萄皮渣∶玉米粉为2∶2∶10∶5 五种含有药用植物的固态培养基。

2.5 菌株P-19中药固态发酵浸提液对不同镰刀菌的抑制效果

表6结果表明,不同配方接种P-19发酵后,对尖孢镰刀菌抑制率不同,其中培养基中甘草∶玉米粉∶木屑=5∶4∶1时发酵7 d后对尖孢镰刀菌抑制率达到67.89%,之后依次为配方甘草∶玉米粉∶木屑=7∶2∶1、甘草∶玉米粉∶木屑=3∶5∶2、甘草∶板蓝根∶葡萄皮渣∶玉米粉=2∶2∶10∶5、板蓝根∶玉米粉∶木屑=3∶5∶2,抑制率分别为63.71%、63.66%、63.50%、60.00%;不同配方接种P-19发酵后,部分处理对接骨木镰刀菌抑制率较尖孢镰刀菌有所提高,板蓝根∶玉米粉∶木屑=3∶5∶2处理发酵7 d后对接骨木镰刀菌抑制率达到67.00%,其次为配方甘草∶玉米粉∶木屑=3∶5∶2、甘草∶板蓝根∶葡萄皮渣∶玉米粉=2∶2∶10∶5,抑制率分别为65.25%、60.85%;不同配方接种P-19发酵后,板蓝根∶玉米粉∶木屑=3∶5∶2处理发酵7 d后对茄病镰刀菌抑制率达到64.48%,其他配方处理抑制率均在60%以下;不同配方接种P-19发酵后,对木贼镰刀菌抑制效果不明显,各处理抑制率均在51.00%以下,其中配方甘草∶板蓝根∶葡萄皮渣∶玉米粉=2∶2∶10∶5发酵7 d后抑制率最高，也仅达到50.20%;不同配方接种P-19发酵后,对锐顶镰刀菌抑制率均较高,其中甘草∶玉米粉∶木屑=3∶5∶2处理发酵7 d后对其抑制率达到78.25%,之后依次为配方板蓝根∶玉米粉∶木屑=3∶5∶2、甘草∶板蓝根∶葡萄皮渣∶玉米粉=2∶2∶10∶5、甘草∶玉米粉∶木屑=7∶2∶1、甘草∶玉米粉∶木屑=5∶4∶1,抑制率分别为77.61%、75.61%、74.46%、74.37%。

表5 绳状青霉P-19的固态发酵效果Table 5 Effect of solid fermentation of Penicillium funiculosum P-19 strain

表6 绳状青霉P-19菌株中药固态发酵产物对不同镰刀菌的抑制效果Table 6 Inhibitory effects of the Chinese medicinal solid fermentation products of Penicillium funiculosum P-19 on Fusarium spp.

3 结论与讨论

青霉是重要的土壤腐生真菌,在不同地区和不同土壤类型都有广泛分布[18],青霉对不同病原菌的作用机制也存在差别,故对不同病原菌的抑制效果不同。本研究结果表明,绳状青霉P-19菌株对尖孢镰刀菌、接骨木镰刀菌、茄病镰刀菌、木贼镰刀菌和锐顶镰刀菌抑制率不同,其中对锐顶镰刀菌的抑制率最高,为64.32%,其次为接骨木镰刀菌和茄病镰刀菌,抑制率分别为45.07%和38.92%,对木贼镰刀菌的抑制率较低,为28.13%。

青霉菌的固体发酵大多使用工业或农业废弃物作为发酵培养基质。常用的固体发酵原料有麦麸、米糠、甘蔗渣、麦粒、花生粉饼、秸秆等。近年来中药渣也渐渐应用到微生物的发酵中。陈燕萍等[19]以微生物发酵床养猪垫料发酵地衣芽胞杆菌Bacilluslicheniformis,结果表明，在最佳发酵培养基和发酵条件下,菌株 FJAT-4 固态发酵物干重活菌体数可达2.63×109cfu/g。杨丽红等[20]进行利用中药渣发酵亮菌Armillariellatabescens研究,结果表明，供试6种中药渣固体发酵亮菌均可产漆酶,培养条件优化后,亮菌漆酶酶活力较使用初始培养基时提高了19倍。本试验利用甘草、板蓝根、药渣、葡萄皮渣等分别与玉米粉、木屑制成固体培养基用于绳状青霉P-19 菌株的发酵,结果表明，不同成分配比下发酵产物对5种镰刀菌抑制效果存在差异,其中配方为甘草∶玉米粉∶木屑配比为5∶4∶1时发酵产物对尖孢镰刀菌的抑制率最高,为67.89%;板蓝根∶玉米粉∶木屑为3∶5∶2时对接骨木镰刀菌的抑制率最高,为67.00%;板蓝根∶玉米粉∶木屑为3∶5∶2时对茄病镰刀菌的抑制率最高,为64.48%。甘草∶板蓝根∶葡萄皮渣∶玉米粉为2∶2∶10∶5时对木贼镰刀菌的抑制率最高,为50.20%;甘草∶玉米粉∶木屑为3∶5∶2时对锐顶镰刀菌的抑制率最高,为78.25%。

通过试验研究,绳状青霉P-19在对峙培养和发酵后对5种镰刀菌都有抑制作用,但是发酵后的绳状青霉P-19在不同培养基种类和配比下对5种镰刀菌的抑制率更高,本试验只对发酵时间进行了初步探索,并且发现不同发酵时间存在明显差异,对其他发酵条件没有做深入的探索,后期将从发酵的pH值、温度、水分等条件进一步优化[21],以期进一步提高对5种镰刀菌的抑制率,为马铃薯土传病害的田间防治提供理论依据。