不同温度下小麦感染不同密度玉米象卵后微环境中二氧化碳浓度变化

刘浩星,王殿轩*,王 甜,黄依林,唐培安

(1.河南工业大学粮食和物资储备学院,国家粮食产业(仓储害虫防控)技术创新中心,粮食储运国家工程研究中心,郑州 450001;2.江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心,南京 210023)

粮食产后储藏中害虫为害造成的损失备受关注,一些发展中国家因储粮害虫造成的粮食损失率达9%～20%[1],我国粮食储藏中害虫防治也受到高度重视。储粮害虫直接取食造成粮食数量和品质损失,也会造成粮食的市场价值损失等[2]。适时有效地检测储粮害虫,监测其发生状态是科学防治害虫的重要基础。对粮食里面可活动或可见到的害虫进行检测的方法已有较多研究和应用[3-8],对粮食隐蔽性害虫的检测方法也有报道和一定应用[9],但总体上处于探讨多应用少。谷物中隐蔽性害虫可直接取食原粮,在粮粒内部生长发育,当其从粮粒内羽化出后,粮粒已受到严重为害,因此通常将隐蔽性害虫列为严重危害性害虫[10]。隐蔽性害虫的幼虫在内部蛀食粮粒后,受损的粮粒及产生的粉屑为不能蛀食完整粮粒的后期性害虫发生提供了有利条件,后期性害虫取食粗屑粮后更加剧了粮食数量和质量损失,大量害虫代谢产生的热量和水分会加速粮情恶化,引起霉变,甚至产生真菌毒素[2,11-13]。隐蔽性害虫藏于粮粒内,常规的检测不易发现它们[10,14],可以说隐蔽性害虫是粮食受损和影响食品安全的重要因素[15]。对隐蔽性害虫进行及时、有效、快速的检测对减少其发生和为害具有重要意义[1],是减少和避免粮食虫害的重要措施。我国现行粮油储藏技术规范GB/T29890中也将玉米象Sitophiluszeamais(Motschulsky)这类幼虫隐藏于粮粒内严重为害的昆虫列为主要储粮害虫[16]。

已报道的检测粮粒中隐蔽性害虫的方法有剖粒检测法[17-18]、声学检测法、ELISA检测法、近红外检测法、X射线检测法、PCR检测法等[1,9,14,19-21],这些方法有的操作过程繁琐,有的受环境干扰大,有的不便现场使用,有的设备价格昂贵不便推广,有的在害虫密度低时检测效果差[22-23]以致缺乏实际应用。“国家标准GB/T24534.4-2009,谷物与豆类隐蔽性昆虫感染的测定 第4部分:快速方法”[24]采用了ISO6639.4 Cereals and pulses-determination of hidden insect infestation -part 4:rapid methods的方法[25],其中主要推荐了二氧化碳(CO2)测定法、茚三酮法、整粒粮漂浮法、声音测定法、X射线法等。研究表明一定条件下害虫的活动会使环境中CO2浓度升高,通过CO2浓度变化可监测害虫发生[26-28]。在GB/T24534.4-2009或ISO6639.4-1987中,推荐采用玻璃仪器与化学试剂结合使用的气体定量分析法和近红外分析仪结合电位记录仪的红外气体分析法来检测CO2浓度,提出了CO2浓度值与害虫感染度的大致关系,根据CO2浓度范围将害虫感染程度划分为轻度、一般、严重感染等[24]。其方法中缺少害虫感染后的发育阶段与CO2浓度的关系,明确这一关系可更好地检测预测害虫发生状态。与前述微环境中用化学法和近红外分析法分析CO2浓度相比,CO2检测仪快速检测技术更加经济、方便,尤其近十年来得到迅速发展[29-30]。本文借鉴GB/T24534.4-2009(ISO6639.4)推荐的微环境容器容积,用CO2快速检测仪并改进为循环取样检测方式，测定了不同温度下感染不同密度玉米象卵后小麦微环境中CO2浓度变化,分析了玉米象发生状态与CO2浓度变化关系,以期为建立新的快速简便方法有效检测隐蔽性害虫提供参考。

1 材料与方法

1.1 小麦

试验用小麦为白皮硬质冬小麦,品种为‘西农979’,容重755 g/L,试验前清除杂质与不完善粒,在60℃处理2 h灭虫,并调节水分含量至12.5%。

1.2 试虫

试验用的玉米象采自河南省郑州市的粮库,后在河南工业大学储藏物昆虫研究室以小麦为饲料在(28±1)℃、RH(70±5)% 条件培养了数代。试验前,在大口玻璃瓶中装入1 kg水分含量13%的无虫小麦,接入羽化14 d的成虫5 000头使其产卵于小麦中,24 h后移出成虫。将感染虫卵的小麦采用酸性品红染色法处理[31],在双目体视显微镜下挑取带有卵斑的小麦作为带虫卵小麦。经前期多批次将带虫卵小麦培养至幼虫期,再抽样剖粒检验其中幼虫出现情况,确认采用上述方法带虫卵小麦的染虫率为95%以上。

1.3 微环境与检测条件

采用高140 mm、瓶身外直径80 mm、瓶口内直径76 mm、容积750 mL的透明玻璃瓶配置硅胶塞加盖设置容器环境。在密封塞上穿2个孔密封设置直径5 mm的塑料管,其瓶外端分别连接CO2气体检测仪的进气和出气端口,瓶内端分别开口于瓶内粮食上部空间和瓶底部(图1)。CO2气体检测仪型号为MS-400,深圳市逸云天电子有限公司生产。量程为0～10 000 mL/m3,精度±0.01% FS,气体流量为500 mL/min,响应时间为30 s。经气密性测试,试验微环境的正压500 Pa的压力半衰期大于2 min。

图1 微环境容器及CO2浓度检测装置示意图Fig.1 Schematic diagram of CO2 monitoring device and microenvironment container

1.4 样品设置

参照GB/T29890-2013粮油储藏技术规范中虫粮等级推荐值[16]设置样品。玻璃瓶中先装入无虫小麦500 g,再按照0、5、10、20粒/kg的密度混入带虫卵小麦(每粒粮带1粒卵,文中用害虫头数计,即 头/kg)。分别装箱置于20、25、30℃的环境中,每隔12 h检测CO2浓度。同时,另设同条件下足量带虫卵小麦于同环境中对照培养,用以参照检查玉米象发育期。每个处理设3个重复。

1.5 数据处理

数据采用Microsoft Excel进行统计,用IBM SPSS Statistics软件进行单因素方差分析,用Duncan氏新复极差法进行多重比较分析。

2 结果与分析

2.1 不同微环境中CO2浓度的变化

3个试验温度下在0.5 d检测时,混入带虫卵小麦的微环境中CO2浓度从0.04%升高至0.053%～0.055%,说明所用方法可检测微小环境中粮食以及虫卵微弱呼吸时产生CO2的浓度变化,但感染害虫的样品与对照试验环境相比,CO2浓度变化差异不显著。

随着玉米象卵的发育,CO2浓度发生了显著变化,在不同温度的微环境中,CO2浓度显著升高的时间明显不同,20℃,感染5、10头/kg和20 头/kg虫卵的小麦微环境中,CO2浓度首次显著升高的时间分别为18.5、18 d和15.5 d,在25℃下分别为12、8.5 d和6.5 d,在30℃下分别为7、5 d和2 d。在相同温度下各个微环境中CO2浓度显著升高的时间随感染害虫的密度增大显著缩短。0.5～34 d期间,感染不同密度害虫的微环境中CO2浓度显著升高的次数差异明显,在20℃时对应地为2、6次和7次,在25℃时对应地为11、12次和14次,在30℃时对应地为13、19次和23次。此过程中,同一温度下微环境中CO2浓度显著升高次数随害虫感染密度增大而增加,相同感染密度下,随温度升高CO2显著升高次数也相应增多。

在测试过程中,不同温度和害虫密度下,CO2浓度达到峰值的时间和大小也有明显差异。20℃时感染5、10头/kg和20 头/kg虫卵的微环境中CO2浓度峰值均出现在34 d时,分别达0.069 7%、0.112 4%和0.128 5%(表1);25℃时对应卵密度下CO2的浓度相应达到峰值0.189 1%、0.285 4%和0.351 7%(表2)的时间分别为23.5、24.5 d和24.5 d;30℃时对应卵密度下CO2的浓度分别达到峰值0.233 5%、0.266 4%和0.468 3%(表3)的时间相应为22、21 d和20.5 d。总体表现为20℃时微环境中CO2浓度峰值小,峰值出现时间晚,且不同害虫密度之间的差异比较小。温度25℃和30℃时微环境中CO2浓度峰值相应增大,峰值出现时间前移,相同卵密度环境下CO2浓度峰值也因温度升高而升高。此过程中无虫卵感染的小麦微环境中CO2浓度变化不明显。

表1 20℃时小麦微环境中感染不同密度玉米象卵后不同发育时期的CO2浓度 1)Table 1 CO2 concentration in the wheat microenvironment corresponded to different developmental stages and densities of Sitophilus zeamais at 20℃

从总体CO2浓度变化趋势看,30℃时检测期内感染害虫的小麦微环境中CO2浓度为达到第1个峰值后出现下降又上升的过程,即相应的CO2浓度从峰值降至0.054 4%、0.067 2%和0.066 2%的谷值,而后又上升至0.094 3%、0.164 9%和0.205 7%。25℃时各卵密度下环境中CO2浓度在检测期内达到峰值后只出现了下降趋势,至第34天时CO2浓度分别降至0.052 5%,0.062 3%,0.065 4%。20℃的微环境中检测期内CO2浓度一直处于增加中。总体上CO2浓度变化趋势与温度及粮粒内害虫虫态有关,20℃低温下害虫发育速度较慢,一直处于卵至幼虫的发育中,呼吸代谢产生CO2量少且增长慢,温度升高至25℃时,粮粒内害虫发育速度加快,大龄幼虫数量增多,产生CO2量增大,而且幼虫发育到了代谢量较小的蛹期,故而又出现CO2浓度再次降低的趋势。温度达到30℃时,幼虫发育更快,测试期间发育到了成虫期,故而出现CO2浓度下降再升高的过程。

表2 25℃时小麦微环境中感染不同密度玉米象卵后不同发育时期的CO2浓度Table 2 CO2 concentration in the wheat microenvironment corresponded to different developmental stages and densities of Sitophilus zeamais at 25℃

表3 30℃时小麦微环境中感染不同密度玉米象卵后不同发育时期的CO2浓度Table 3 CO2 concentration in the wheat microenvironment corresponded to different developmental stages and densities of Sitophilus zeamais at 30℃

续表3 Table 3(Continued)

2.2 不同温度下玉米象发育期与微环境中CO2浓度变化关系

总体上,在玉米象发育过程中,卵为不取食虫态,代谢产生CO2量微小,相应微环境中CO2浓度变化不显著。进入幼虫期后,随着虫龄增加、害虫个体增大,取食和代谢量相应增加,CO2浓度随之增加。由于温度高时害虫生长发育加快,代谢产生的CO2量更多,因此CO2浓度增加更快。进入蛹期后代谢率降低故而微环境中CO2浓度再次降低。温度30℃时的检测末期(第29天前后),蛹羽化出成虫后,因其取食代谢再次升高,CO2浓度又有升高。见表1～表3。

2.2.120℃时幼虫发育较慢,微环境中CO2浓度一直处于上升中

表1显示,温度20℃时,当玉米象从卵发育到1龄幼虫时,密度为5头/kg和10头/kg的小麦微环境中CO2浓度增加不明显,而20头/kg的小麦微环境中CO2浓度变化较为明显。当玉米象发育至2龄幼虫时3个密度微环境中CO2浓度均显著增加。玉米象发育至3龄幼虫时,密度为5头/kg的微环境中CO2浓度与2龄幼虫期时相比增加不明显,密度10头/kg和20头/kg的微环境中CO2浓度比2龄幼虫期有显著性增加。玉米象发育至4龄幼虫时,密度5头/kg的微环境中的CO2浓度增加不明显,10头/kg和20头/kg微环境中的CO2浓度则均较前面龄期有显著增加。

2.2.225℃时幼虫发育至蛹期,微环境中CO2浓度上升又有下降

表2显示,温度25℃时,1龄幼虫期内3个密度微环境中的CO2浓度均有显著增加,同一时间不同密度样品间的CO2浓度差异显著。在2龄、3龄和4龄幼虫期内,微环境中CO2浓度均较对应的前一龄期显著增加,同龄期不同密度的微环境中CO2浓度差异显著。至4龄幼虫及其后期,微环境的CO2浓度又有降低。至蛹期时,微环境中CO2浓度与卵期的值相近。

2.2.330℃时幼虫发育到蛹再至成虫羽化,微环境中CO2浓度出现上升下降再上升

表3显示,温度30℃时,1龄幼虫期内,3个虫口密度微环境中CO2浓度均有显著增加,且增幅更大。2龄幼虫期内,5头/kg的微环境中的CO2浓度与其前期相比增加不明显,10头/kg和20头/kg的微环境中CO2浓度则增加显著。3龄幼虫期内,3个密度微环境中CO2浓度增加更加显著。4龄幼虫期内,其前期微环境CO2浓度继续增加,后期在化蛹进程中微环境CO2浓度又有降低,至蛹期时降至最低值,再后又随新羽化且暂隐藏于粮粒内的成虫出现再度增高。

3 结论与讨论

干燥储藏的谷物通常自身呼吸代谢率低,密闭环境中产生的CO2量也很微小,当其中有害虫感染时,昆虫的呼吸代谢会促使密闭环境中CO2浓度显著升高,借此可通过CO2浓度变化检测隐蔽性害虫的发生。《GB/T24534.4-2009 谷物与豆类隐蔽性昆虫感染的测定 第4部分:快速方法》中推荐了玻璃仪器组成的装置与化学试剂结合使用的气体定量分析法,以及近红外分析仪结合电位记录仪的红外气体分析法,来检测与本研究中同容积微环境中的CO2浓度变化。在气体定量分析法中,微环境封闭24 h时CO2浓度小于等于0.2%视为无感染,浓度在0.3%～0.5%、0.6%～0.9%和大于等于1.0%时分别视为轻度、轻度至中度和重度感染。在红外气体分析法中,每千克样品产生CO2速率小于等于1.1 μL/min视为无感染,速率在1.0～1.9、2.0～3.9、4.0～5.9 μL/min 和大于等于6 μL/min时分别视为轻度、轻度至中度和重度感染,这两个方法中均未明确测定浓度条件下感染的害虫发育期和感染害虫密度。本研究试验温度和感染密度下，当玉米象发育处于卵期时,CO2浓度变化均不显著。温度20℃时,小麦中玉米象密度5、10头/kg和20 头/kg的处理在玉米象进入幼虫期时CO2浓度分别于18.5、18 d和15.5 d第1次出现显著升高;温度25℃时,CO2浓度分别于12、8.5 d和6.5 d出现第1次显著升高;温度30℃时,CO2浓度分别于7、5 d和2 d时第1次出现显著升高。实际类似环境中,可通过相近时期CO2浓度的类似变化,参考本结果推算粮食中隐蔽性害虫尤其是玉米象的发生状态。

玉米象可在田间感染小麦等谷物[32],收获入仓后其卵、幼虫、蛹和成虫初期均隐藏于粮粒内,至其在粮粒内成虫羽化时,籽粒几乎被完全损毁。害虫密度较大时蛀食造成数量损失严重,被蛀粮粒的质量也受到严重影响。对新收获入仓的粮食中的隐蔽性害虫进行检测,有助于有计划地指导科学入仓管理和后期及时防治。在已报道的隐蔽性害虫检测方法[17-21]中CO2检测法是一种快速的检测方法[33]。本研究采用便携式CO2快速检测仪(一种用于检测隐蔽性害虫的装置,专利号:ZL201921286028.0)结合循环取气检测,更加便捷迅速,循环取气检测对浓度值影响也较小,在操作的方便性、经济性、有效性方面更有优势。研究结果初步明确了CO2浓度变化与害虫发生期、害虫发生密度及环境温度之间的关系,可通过检测微环境CO2浓度掌握粮食中隐蔽性害虫的发生情况。