链格孢菌株HY-063的分离鉴定及除草潜力

李 欢,朱海霞

(青海大学农林科学院,青海省农业有害生物综合治理重点实验室,农业农村部西宁作物有害生物科学观测实验站,西宁 810016)

杂草在农田中与农作物争夺养分、水分、阳光和空间,大大降低了农作物的产量和品质[1]。据估计,由于杂草的竞争,农作物产量损失约为20%～35%[2]。在中国,杂草造成的损失估计达数十亿美元[3]。目前的杂草防治途径主要是利用化学除草剂,由于化学除草剂的大量施用已造成环境污染、杂草产生抗药性、农药残留量大、毒害有益昆虫等负面影响[4-5]。随着社会文明的发展和公众健康意识的提高,开发广谱、高效、低毒的新型微生物除草剂和生物除草技术已成为大势所趋。

链格孢属真菌具有寄主范围广,传播途径多,侵染能力强等特点。全球已有超过500种链格孢的记录,该菌能引起多种经济植物病害,如银杏叶斑病[6]、杨树叶枯病[7]、梨黑斑病[8]、核桃枯叶病[9]、铁皮石斛枯梢病[10]、瓜果嫁接苗棕斑病[11]、烟草赤星病[12]、马铃薯早疫病[13]、白菜黑斑病[14]等。在杂草生物防治方面,链格孢也表现出广阔的应用前景,已报道有10多种链格孢用于杂草防治[15]。Lawrie等[16-17]研究表明，链格孢Alternariaalternata可作为防除反枝苋Amaranthusretroflexus的生防菌,吴兆圆等[18]从感病的马唐Digitariasanguinalis植株上分离到具有除草活性的链格孢属真菌A.perpunctulataNBERC_H56,其发酵液对马唐生长有着显著的抑制作用。王禹博等[19]将链格孢A.alternataSC-018发酵液进行环境生物安全评估,发现可将其应用在水稻田野慈姑等杂草的防除中。万佐玺等[20]和常缨等[21]的研究表明,寄生于紫茎泽兰Ageratinaadenophora的链格孢产生的毒素有广谱除草活性,具有开发为防除紫茎泽兰及其他杂草的生物源除草剂的潜力。Kausar等[22]的研究表明,A.brassicicola和A.gaisen的培养滤液对银胶菊Partheniumhysterophorus有抑制作用。随着研究不断深入,链格孢作为杂草生防菌的地位逐渐提升,对农田杂草防除起到积极作用。

本研究以自然罹病的老鹳草GeraniumwilfordiiMaxim.叶片上分离得到的链格孢菌株HY-063作为研究对象,并通过形态特征和分子生物学技术相结合的方法对菌株进行分离鉴定,采用柯赫氏法则验证其致病性,离体、活体接种法测定其对青海省常见阔叶杂草的防除效果,作物活体接种法明确该菌株对常见作物的安全性,为将该菌应用于更广泛的阔叶杂草生物防治奠定基础。

1 材料与方法

1.1 病原菌的分离纯化

2021年8月5日从青海省湟源县采集自然感病的老鹳草叶片,按地理位置分类编号,装入自封袋。

用常规组织分离法和单孢分离法进行分离[23-24],杂草病样用清水洗净,剪取5 mm2病健交界处组织,经表面消毒后接种在PDA培养基上于25℃下培育5～7 d,单孢纯化后置于4℃冰箱保存备用。

1.2 病原菌鉴定

1.2.1形态学鉴定

将菌株HY-063置于PDA平板上于25℃培养箱中L∥D=12 h∥12 h光暗交替培养,观察菌落生长速率、菌落外形及色泽变化,光学显微镜下观察其菌丝和孢子形态。参照《中国真菌志链格孢属》[25]及《Alternaria,an identification manual》[26]的描述对该菌进行形态学分类与鉴定。

1.2.2分子鉴定及系统发育树的构建

采用CATB法[25]提取菌株的基因组DNA。分别用通用引物ITS1和ITS4[28]、EF1-728F和 EF1-986R[29]、Alt-for和 Alt-rev[30](表1)进行 PCR扩增,引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR反应体系均为25 μL:正反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL,DNA 模板 0.5 μL,10×PCR buffer 2.5 μL,Taq酶0.2 μL,ddH2O补齐。PCR反应程序设置如下:94℃预变性5 min;94℃变性45 s,55℃退火45 s,72℃延伸1 min,30 个循环；72℃延伸10 min,4℃保温。扩增完成后进行电泳检测,用SanPrep柱DNA J凝胶回收试剂盒(SK8131,上海生工)回收纯化的产物,并送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序,测序所得到的核苷酸序列与 GenBank中序列进行 BLAST 比对分析,利用 Clustal X 1.8 和MEGA 7.0对序列进行比较分析,采用邻接法(neighbor-joining,NJ)对rDNA-ITS、EF-1α和Alta1序列进行聚类分析,构建多基因序列系统发育树[31]。并用自展法(bootstrap method)进行检验,重复次数1 000次,以分析该菌与同属不同种菌株间的亲缘关系[32]。

表1 本研究所用的引物Table 1 Primers used in this study

1.2.3柯赫氏法则验证

从试验田采集新鲜、健康的老鹳草叶片用75%乙醇表面消毒5 min,无菌水冲洗3次,晾干。菌株连续活化3代,PDA平板上培养5 d。活化后取直径为 0.8 cm 的菌饼倒置接种至老鹳草叶片上。以只接种无菌PDA琼脂块作为对照组,每处理重复3次,接种的老鹳草放置于(25±1)℃,L∥D=12 h∥12 h的光照培养箱中培养,7 d后观察叶片症状。按组织分离方法从接种后的发病组织中再次分离病原菌,两次分离的菌株在形态上一致则可以确定为病原菌。

1.3 生防菌株HY-063对几种杂草的致病力测定

1.3.1菌丝块的致病性测定

从青海大学农林科学院试验田采集健康新鲜的酸模叶蓼PersicarialapathifoliaL.、藜ChenopodiumalbumLinnaeus、冬葵Malvaverticillatavar.crispa、密花香薷ElsholtziadensaBenth.、猪殃殃GaliumspuriumL.、反枝苋AmaranthusretroflexusL.的叶片,用无菌水冲洗3次后自然晾干,然后放置于垫有无菌滤纸的培养皿中(d=9 cm),每皿3～4片,无菌水浸湿滤纸提供湿润的环境。从培养7 d的菌落边缘打取菌丝块(d=8 mm)接种到叶片正面,以接种无菌PDA培养基块为对照,每处理设置3次重复,置于(25±1)℃,L∥D=12 h∥12 h的光照培养箱中培养,观察叶片发病情况。

1.3.2发酵滤液的致病性测定

菌丝块接种到PDB培养液(250 mL/瓶)中,每瓶5块,在25℃、180 r/min的转速摇动培养120 h，用4层灭菌纱布过滤后得到发酵滤液,用喷雾接种法连续3 d接种到正常生长的4～7叶期的盆栽杂草植株上,接种量25 mL/盆。接种后的杂草植株用塑料袋套袋保湿培养24 h后,放置于25～30℃、L∥D=12 h∥12 h人工气候箱中,每处理重复3次,以接种无菌PDB培养液的植株作为对照,7 d 后观察接种杂草的发病情况,计算发病率和鲜重防效。

1.4 生防菌株HY-063对作物的安全性

将5种青海主栽作物蚕豆Viciafaba、豌豆Pisumsativum、青稞Hordeumvulgare、小麦Triticumaestivum和油菜Brassicanapus分别种植于d=12 cm的花盆中,置于室内培养。HY-063发酵液稀释后,按上述1.3.2方法接种于 3～6 叶期的作物植株上。每处理重复3次,以接种无菌PDB培养液的作物作为对照,7 d 后调查发病情况。作物的安全性评价标准为:NS 表示植株无症状(无病斑,植株正常生长);LS表示有轻微影响(叶子上散布着零星病斑,生长发育稍受控制);MS表示中等感病(1/5～1/4的叶面积出现病斑,生长受抑制);SS 代表严重感病(植株大量枯死,生长发育受严重控制)。

1.5 数据统计分析

采用Excel和SPSS 25.0对试验数据进行统计分析,并使用单因素方差分析(ANOVA)和最小显著性差异法(LSD)比较差异显著性。

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定

HY-063菌落在PDA平板上初期为白色,后期逐渐发展为橄榄色或深绿色丝绒状,边缘整齐。气生菌丝密集。菌丝无色有隔膜。分生孢子呈棕褐色或黑褐色,椭圆形、卵形、棒状或倒梨形,有2～5个横隔,0～3个纵隔,分隔处略有缢缩,喙为圆柱形或圆锥形(图1)。根据致病菌的培养特征和形态特点,该致病菌初步确认为链格孢Alternariasp.

图1 菌株HY-063的形态特征Fig.1 Morphological characteristics of strain HY-063

2.2 分子生物学鉴定结果及系统进化树

对菌株HY-063的rDNA-ITS、EF-1α、Alta1基因序列进行PCR扩增,获得了3个长度依次为533、264 bp和477 bp的基因片段。根据病原菌rDNA-ITS、EF-1α、Alta1基因序列,以Ulocladiumconsortiale为外群构建菌株的系统发育树,发现HY-063与Alternariaalternata在系统发育树上聚在一起,且支持率为99%,通过这3个基因序列可以准确地将链格孢与其他物种分离出来,总体上表现出良好的保守性。根据HY-063的3个基因序列的系统发育分析结合形态特征,将菌株HY-063鉴定为链格孢A.alternata。

2.3 柯赫氏法则验证结果

利用柯赫氏法则,对菌株HY-063回接老鹳草进行致病性验证,试验结果显示,接种菌株3 d后,老鹳草叶片开始出现病状,叶片接种位置出现穿透现象;5 d后病斑逐渐扩大向外延伸,开始出现褐色病斑;7 d后叶片黑褐色腐烂,部分病斑扩大连成片,引起叶片枯死(图3)。从发病的叶片上再次分离的病原菌与原接种菌株菌落形态完全相同,验证了该菌株的致病性。

2.4 对离体叶片的致病力

如图4所示,采用HY-063菌丝块接种离体叶片后,藜、密花香薷、冬葵、酸模叶蓼叶片均有大量白色菌丝产生,菌丝侵染产生大小不一的褐色病斑,病斑四周呈现黄褐色,且伴有失绿症状,7 d后4种杂草叶片95%发黑腐烂。猪殃殃叶片先是有大量菌丝生成,随后接种部位出现萎蔫。反枝苋叶片先出现病斑,之后病斑逐渐扩大,最终40%的叶片发黑发黄枯死。HY-063菌丝块对不同杂草离体致病性强弱表现为:藜>密花香薷>冬葵>酸模叶蓼>反枝苋>猪殃殃。

图2 基于rDNA-ITS,EF-1α和Alt a 1基因序列联合构建的菌株HY-063 NJ系统发育树Fig.2 NJ phylogenetic tree of HY-063 and relative strains based on the combined rDNA-ITS,EF-1α and Alt a 1 gene sequences

图3菌株HY-063对老鹳草的致病性验证Fig.3 Pathogenicity test of strain HY-063 to Geranium wilfordii

2.5 对盆栽苗的致病性

如图5所示,喷施HY-063发酵滤液后7 d,6种杂草均出现不同程度的症状。藜出现萎蔫、逐步褪绿变黄,最后整株枯死;密花香薷出现大面积病斑,叶片有卷曲且干枯;冬葵、酸模叶蓼叶片出现少量病斑,后病斑逐渐蔓延;猪殃殃叶片卷曲,茎叶枯死后植株全部萎蔫;反枝苋植株叶缘部位卷曲且干枯,部分植株开始枯萎。7 d后杂草无恢复迹象。根据发病率、鲜重防效的结果(表2)分析,藜、密花香薷、猪殃殃发病率高达90%以上,鲜重防效达80%以上。试验结果表明,该菌株发酵滤液对猪殃殃、藜和密花香薷具有较好的防除效果。

2.6 作物安全性

HY-063发酵滤液对蚕豆、豌豆、小麦、青稞相对安全,试验作物与空白对照相比长势及株高没有受到任何影响,表现为无反应(NS);油菜症状为轻微反应(LS),部分叶片上有少许褐色病斑,后期呈现发黄萎蔫病状,油菜株高抑制率为3.6%,感病率为4%(表3),后期病情不扩展。

表2 菌株HY-063发酵滤液对不同杂草的致病性1)Table 2 Pathogenicity of strain HY-063 to different weeds

图4 菌株HY-063对不同杂草离体叶片致病性(接种7 d)Fig.4 Pathogenicity of strain HY-063 against detached leaves of different weeds (seven days after inoculation)

图5 菌株HY-063对盆栽杂草的致病性(接种后7 d)Fig.5 Pathogenicity of strain HY-063 against potted weeds (7 d after inoculation)

表3 供试作物对菌株HY-063的敏感性1)Table 3 Susceptibility of test crops to strain HY-063

图6 菌株HY-063对作物的安全性(接种后7 d)Fig.6 Safety of strain HY-063 to crops (7 d after inoculation)

3 结论与讨论

本试验从自然发病的老鹳草叶片分离得到菌株HY-063,经形态学观察结合分子生物学鉴定,将该菌株确定为链格孢A.alternata。将HY-063 喷施于阔叶杂草藜、密花香薷、猪殃殃、冬葵、酸模叶蓼和反枝苋后,可导致6种杂草叶片发黄枯萎甚至整株枯死,接种于5种主栽作物后,除油菜有轻微发黄萎蔫的症状,蚕豆、豌豆、青稞和小麦4种作物无不良反应。

近年来随着分子生物学技术的快速发展,核糖体DNA内转录间隔区(rDNA-ITS)序列、翻译延伸因子(EF-1α)基因序列、抗原相关蛋白基因(Alta1)序列、磷酸脱氨酶(gpd)、肌动蛋白基因(ACT)、钙调蛋白基因(CAL)、组蛋白基因(HIS)等核苷酸序列分析技术在真菌分类上已广泛应用,这些基因对链格孢属与其相近属及种间界定等发挥了一定作用。如于华荣等[33]利用EF-lα和rDNA-ITS基因序列分析通辽市高粱叶斑病的病原菌为交链孢A.alternata。王春明等[34]使用EF-lα、rDNA-ITS和Alta1基因序列相结合的分析技术,确认了二月兰Orychophragmusviolaceus叶斑病病原菌为甘蓝链格孢A.brassicicola,李凯旋[35]利用序列rDNA-ITS、GDP和TEF将紫藤Wisteriasinensis叶斑病的病原菌鉴定为A.alternata。本研究通过rDNA-ITS、EF-1α和Alta1三基因序列结合形态特点,对分离自老鹳草的HY-063菌株的种类鉴定及系统发育问题展开了研究,更易于在分子水平上了解A.alternata菌种的遗传特征与进化状况。

大量研究表明,能够分泌除草活性毒素的植物病原真菌主要集中在链格孢属,来源于不同罹病植物的链格孢可产生多种毒素成分,应用于杂草防治研究。从紫茎泽兰Ageratinaadenophora上分离获得的链格孢能产生致病毒素,代谢产物中分离到的细交链格孢菌酮酸(简称TeA毒素)通过抑制紫茎泽兰叶片光系统Ⅱ的电子传递从而对其产生毒害作用[36-37]。此外,ALL-毒素对龙葵Solanumnigrum、曼陀罗Daturastramonium和紫茎泽兰都有很好的防除效果[20]。百日链格孢Alternariazinniae产生的除草活性物对苍耳Xanthiumstrumarium、紫茎泽兰、加拿大一枝黄花Solidagocanadensis、小蓬草Erigeroncanadensis等菊科杂草及农田、园林和草坪杂草均显示具有一定的致病活性[38]。Zhao等[39]从A.alternataZHJG5菌株中分离出二苯a-吡喃酮衍生物,研究发现其可开发为新农药先导化合物。本试验在探索菌株HY-063的除草活性时,首先采用菌饼接种法确定了该菌株具备除草活性,进一步以菌株发酵滤液接种活体盆栽植株,评价了该菌株对藜、猪殃殃和密花香薷等6种杂草的除草作用,确定了菌株HY-063活性物质存在于代谢产物中,下一步将对活性物质进行系统鉴定。

本文从致病性、作物安全性以及形态分子鉴定方面展开了基础研究,表明链格孢菌株HY-063具有开发成为豆科(蚕豆、豌豆)和禾本科(青稞、小麦)作物田防除阔叶杂草微生物除草剂的潜力。有必要将该菌株的除草机理、田间验证、剂型研制等进行更深入系统的研究,为天然除草剂的研究开发提供备选资源。