天然小分子HEP-14抗黑色素瘤细胞SK-Mel-103的作用研究

刘 芳，钟 沁，王 贤，韦睿然，桂黎明

550004 贵阳，贵州医科大学：基础医学院免疫学教研室1，组织工程与干细胞实验中心2；230031 合肥，安徽医科大学临床医学院基础医学部3

人类恶性黑色素瘤是一种具有高度侵袭性的癌症。由于肿瘤异质性，其中包含致瘤性不断增强的癌细胞亚群，使其成为难治的耐药性肿瘤之一。同时，伴随对黑色素瘤发展的分子机制和遗传分析的深入研究，黑色素瘤也是其他转移性癌症诊治的理想研究模型[1]。早期手术切除黑色素瘤后的根治率较高，但残余或晚期黑色素瘤仍具有较高的恶性转移能力和侵袭性，靶向治疗(如BRAF抑制剂、MEK抑制剂等)[2]、免疫治疗(如单抗PD-1抗体或与抗CTLT-4抗体联合使用)的发展[3]，已使晚期黑色素瘤患者的临床治疗显著改善，总体生存率提高，但这些药物治疗成果也仅限于某类黑色素瘤患者，而且在治疗过程中可能伴随致癌信号通路的再激活、脱靶效应及耐药基因的出现，导致治疗后复发和再次转移[4-5]。因此，需要开发新的药物来克服目前治疗药物的局限性。黑色素瘤中不同亚型之间存在特异或差异性基因的表达(如PENT、NRAS、TP53、CDKN2A、MITF)[6]，基因表达的差异决定了黑色素瘤的组织病理特征、远处转移部位和速度、药物治疗效果，也因此区别不同的黑色素瘤亚型[7-8]。可见恶性黑色素瘤的药物开发，是基于可靠的分子筛查靶点。

CD271是一种低亲和力神经生长因子(low-affinity nerve growth factor, NGF)受体或p75神经营养因子受体，是肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor, TNFR)超家族成员，在多种癌组织中表达并发挥重要作用。10个黑色素瘤中有9个呈现异质性表达CD271[9]。CD271作为黑色素瘤起始细胞(MICs,又称黑色素瘤干细胞)亚群的重要标志物[10-11]，与肿瘤细胞形成、迁移和复发密切相关[12]。无论CD271是否作为黑色素瘤干细胞亚群的标记物[11]，它在黑色素瘤中的作用已被充分证实，抑制CD271的表达能降低肿瘤形成能力和体外细胞迁移能力[13-15]。STAT3在癌症中发挥着重要作用[16-17]，在高表达CD271的黑色素瘤转移病灶中，同时检测到被高度激活的STAT3[15-16,18]，其依赖的信号通路在介导黑色素瘤细胞向肺部、大脑转移的过程中同样起到关键的调控作用[19]；提示黑色素瘤中CD271的表达可能与STAT3依赖的信号通路调控相关。

天然小分子作为治疗药物具有较高的组织和肿瘤渗透率，可以相对容易地穿过细胞膜和其他生物屏障，进入细胞内靶点[20-21]。HEP-14(5β-O-angelate-20-deoxyingenol)是从天然植物南欧大戟中提取的天然小分子，是一种类似于吲哚或吲哚甲丁酸酯的化合物。研究显示HEP-14 家族化合物能调控子宫颈癌HeLa细胞、神经母细胞瘤和肝癌细胞的溶酶体生物发生，且HEP-14可显著减少阿尔茨海默疾病模型小鼠脑部淀粉样蛋白沉积斑块的累积，是溶酶体相关疾病的可行治疗选择[22]。本课题组在前期用黑色素瘤细胞对HEP-14做活性筛查时发现天然小分子HEP-14对黑色素瘤细胞的表型和生长有较强抑制作用，但其在黑色素瘤中的抗肿瘤机制尚不清除。因此本研究旨在运用天然小分子HEP-14作用于黑色素瘤细胞SK-MEL-103，观察其对黑色素瘤的影响及初步探讨其可能的机制，为后期深入研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

天然小分子HEP-14由中国科学院昆明植物所郝小江院士组提取和赠送[22]。用DMSO配制成10 mmol/L储存液，保存在-20℃冰箱备用。DMEM细胞培养基(货号C1995500BT)、0.25% 胰酶(货号25200-056)、双抗(货号 15140122)购自美国Gibco公司；胎牛血清(货号 SE100-B)购自北京宏岭隆成科技有限公司；二甲基亚砜(DMSO，货号D8371)、ANNEXIN V-Alexa Fluor 647/PI Kit凋亡检测试剂盒(货号 CA1050)、高效RIPA组织/细胞裂解液(货号 R0010)、细胞周期试剂盒(货号 CA1510)购自Solarbio公司；细胞增殖与毒性检测试剂(CCK8，货号GK10001)购自GLPBIO公司；BCA蛋白定量/浓度测定试剂盒(货号 ES6002)、RNA-Quick purification Kit (货号RN001)、2X Super SYBR qPCR Master MIX(货号 QP002)、快速逆转录试剂盒(货号RT001)购自上海奕杉生物科技有限公司；5×蛋白加样缓冲液(货号 GF1811)购自Genefist公司；Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) HRP(货号 S0001)、β-actin(货号AF7018)、CD271(货号AF0360)、STAT3(货号AF6294)、p-STAT3(Tyr705，货号AF3293)购自Affinity公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人黑色素瘤SK-Mel-103、SK-Mel-147、SK-Mel-28细胞株由María S. Soengas博士(西班牙国家癌症研究中心)赠送。SK-Mel-103细胞复苏后，接种于含10%的胎牛血清及1%双抗的DMEM高糖培养基，置于5%CO2、37 ℃恒温培养箱中培养。2～3 d传代1次，取对数期细胞进行实验，分别用不同浓度HEP-14处理细胞，每个浓度组至少3个重复。

1.2.2 CCK8实验测定细胞活力与增殖 取对数生长期的细胞按每孔5×103个接种于96孔板，细胞贴壁后，用HEP-14(2.5，5，10，20，40 μmol/L)处理后继续培养24～72 h，每个浓度组设置4个复孔。培养结束时，每孔加入10 μL CCK-8试剂，避光培养2 h，酶标仪测定450 nm处的光密度值，计算细胞存活率，公式为细胞存活率=[D(450)实验孔-D(450)空白孔)]/[D(450)对照孔-D(450)空白孔]×100%。用Graphpad Prism 6.0 软件计算药物半数抑制浓度(IC50)。

1.2.3 平板克隆形成实验检测细胞增殖能力 药物处理72 h后，每个浓度组取2 mL细胞悬液(约5×102个细胞) 接种到12孔板中，置于培养箱继续培养2周，每3天更换培养基，当有肉眼可见的克隆出现时终止培养，弃去培养基，甲醇固定后结晶紫染色，计数细胞克隆数，大于50个细胞的集落记为有效克隆，实验重复3次。

1.2.4 细胞形态观察 将细胞以2×105/孔接种于6孔板，待细胞贴壁后更换含HEP-14(5, 10, 20 μmol/L)的培养基继续培养24～72 h。待培养结束时，用倒置显微镜观察并拍摄每个浓度组细胞形态变化。

1.2.5 Transwell迁移实验检测各浓度组细胞纵向迁移情况 取对数生长期细胞接种于12 孔板内，分别为空白组和HEP-14组，每组3个复孔。孵育24 h， HEP-14作用48 h后的细胞用含0.1% BSA的DMEM培养基分别配成2.5×105/mL 细胞悬液，将小室放入24 孔板内，下室加入含20% FBS的培养基750 μL，上室加入细胞悬液 200 μL，孵育箱内培养 24 h。移去培养基，PBS 润洗2次，去除上室未迁移细胞，4%多聚甲醛固定5 min，移去甲醛，PBS 润洗2次，1%结晶紫染液避光染色30 min，PBS润洗2次，棉签擦干上室内未迁移细胞，倒置显微镜下拍照。

1.2.6 细胞周期 胰酶消化各组细胞后，用预冷的70%乙醇固定细胞，4 ℃ 过夜，第2天用PBS洗涤细胞2次，收集沉淀。将RNase A∶PI 按1∶9体积配制成染色工作液，500 μL PI/RNase A 染色工作液重悬细胞，避光孵育30 min 后，流式细胞仪记录在488 nm 激发波长处红色荧光，检测细胞周期。

1.2.7 细胞凋亡检测 用HEP-14(5，10，20 μmol/L)处理细胞72 h，待培养结束时，用不含 EDTA 的胰蛋白酶消化细胞，PBS 洗涤，1×结合缓冲液重悬细胞，调节细胞浓度为(1～6)×106/mL，取100 μL细胞悬液于流式管中，加入5 μL Annexin V-Alexa Fluor 647混匀后室温避光5min，加入10 μL 20 μg/mL的溴化丙啶溶液(PI)，加400 μL PBS，利用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.2.8 RT-qPCR分析mRNA表达 HEP-14(5，10，20 μmol/L)处理SK-Mel-103细胞72 h，收集各组细胞，提取总RNA，逆转录为 cDNA，进行定量PCR扩增反应，每组设3个复孔，重复至少3次。扩增条件为: 95 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，共进行40个循环。以 2-ΔΔCt法计算mRNA的相对表达量，所使用基因及引物序列如下：β-actin上游引物5′-GTGCTATCCCTGTACGCCTC-3′，下游引物5′-CGGACTCGTCATACTCCTGC-3′；STAT3上游引物5′-CAGCAGCTTGACACACGGTA-3′，下游引物5′-AAACACCAAAGTGGCATGTGA-3′；CD271上游引物5′-CCGTTGGATTACACGGTCCAC-3′，下游引物5′-TGAAGGCTATGTAGGCCACAA-3′。

1.2.9 Western blot检测蛋白表达 将对数生长期的细胞，以2.5×105/mL 接种于6孔板，待细胞贴壁后，分别将终浓度为5，10，20 μmol/L 的HEP-14处理72 h。用RIPA(含PMSF 蛋白酶抑制剂)裂解液提取蛋白，BCA 法测定蛋白浓度，蛋白变性。蛋白样品每孔20 μg 经 PAGE 凝胶电泳后转至 PVDF 膜，5% 脱脂牛奶封闭2 h，4 ℃ 孵育一抗过夜(1∶1 000)，1×TBST洗涤3次，二抗(1∶3 000)室温孵育1.5 h，采用ECL显影液显色，凝胶成像系统拍照，Image J软件分析。

1.2.10 细胞免疫荧光染色分析 不同浓度HEP-14处理后的细胞接种于盖玻片上，4%多聚甲醛固定 30 min，0.1% Triton X-100 通透 15 min，室温下5% 牛血清白蛋白中封闭30 min，4 ℃ 湿盒孵育一抗过夜，PBS 洗涤细胞，室温下羊抗兔IgG(H+L)-Fluor 594孵育1 h，用 4′,6- 二脒基 -2- 苯基吲哚 (DAPI)核染15 min，PBS 洗涤3次，防淬灭剂封片后荧光显微镜下观察。

1.2.11 生物信息学分析黑色素瘤STAT3和CD271相关性 使用GEPIA(http://gepia.caner-pku.cn/)在线网站进行生物信息学分析。登录GEPIA网站，点击“Correlation”基因相关性分析模块，Gene A与Gene B分别输入STAT3与CD271的基因名称，即STAT3与NGFR，相关系数选择默认的Pearson相关系数，数据集选择TCGA Tumor数据库中SKCM Tumor数据集，点击“Plot”，生成相关性分析图表[23]。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 HEP-14有效抑制SK-Mel-103细胞生长

检测天然小分子HEP-14对高恶性黑色素瘤细胞SK-Mel-103的细胞毒作用，用不同浓度的HEP-14分别与SK-Mel-103 细胞作用24、48、72 h，CCK-8 结果显示与未处理组细胞相比，HEP-14降低了SK-Mel-103的细胞活性(P<0.05，P<0.01)，24、48、72h IC50值分别为37.81、21.9、11.06，且HEP-14作用的细胞毒性呈时间、剂量依赖性(图1A)。显微镜下形态学观察显示，随着HEP-14作用浓度和时间的增加，细胞数量和大小也明显减少，10 μmol/L HEP-14作用时间72 h，出现明显细胞碎片、不定形细胞(图1B)，说明天然小分子HEP-14能有效抑制黑色素瘤SK-Mel-103细胞的生长。

2.2 HEP-14抑制SK-Mel-103细胞增殖，促进细胞凋亡

通过克隆形成实验探讨HEP-14对SK-Mel-103细胞克隆集落形成的影响，如图2A所示，与空白对照组相比，5、10、20 μmol/L HEP-14组SK-Mel-103细胞的克隆数减少(P<0.05)，提示HEP-14对SK-Mel-103细胞具有抑制作用，且抑制具有显著的浓度依赖性。流式细胞术分析天然小分子HEP-14对细胞周期的影响(图2B、C)，与0 μmol/L HEP-14组相比，5、10、20 μmol/L HEP-14组细胞以浓度依赖的方式出现G2/M 期阻滞(P<0.05，P<0.01)，表明天然小分子HEP-14可能通过诱导SK-Mel-103细胞G2/M 的周期阻滞，抑制细胞增殖。为了进一步研究HEP-14对SK-Mel-103 细胞的诱导凋亡作用，采用Annexin V/PI 染色进行流式细胞术分析 (图2D、E)，结果表明HEP-14作用细胞72 h，与0 μmol/L HEP-14组相比，随着HEP-14作用浓度的增加，细胞早期凋亡、晚期凋亡比例随之增加(P<0.05，P<0.01)，说明HEP-14能诱导黑色素瘤细胞SK-Mel-103的凋亡。

A：CCK8检测不同浓度HEP-14对黑色素瘤细胞SK-MEL-103生长的影响；B：不同浓度HEP-14处理黑色素瘤细胞SK-MEL-103形态观察 a: P<0.05，b:P<0.01，与空白对照组(0 μmol /L)比较

A：不同浓度 HEP-14对SK-MEL-103细胞克隆形成的影响；B：不同浓度HEP-14对黑色素瘤细胞SK-MEL-103周期的影响；C：不同浓度HEP-14处理后黑色素瘤细胞SK-MEL-103各周期比例；D：流式细胞仪检测不同浓度 HEP-14对黑色素瘤细胞SK-MEL-103凋亡的影响；E：不同浓度HEP-14处理后黑色素瘤细胞SK-MEL-103凋亡细胞比例 a: P<0.05，b:P<0.01，与空白对照组(0 μmol/L)比较

2.3 生物信息学分析黑色素瘤组织中STAT3 mRNA与标记物 CD271 mRNA的表达水平

利用GEPIA数据库分析黑色素瘤组织STAT3 mRNA与标志物CD271 mRNA表达的相关性，结果显示CD271 mRNA与STAT3 mRNA的表达呈正相关(r=0.14，P<0.01，图3)，提示CD271的表达可能与STAT3有关。

图3 GEPIA 数据库分析黑色素瘤组织中STAT3 mRNA 与 NGFR mRNA 表达的相关性

2.4 HEP-14抑制STAT3磷酸化，下调CD271表达和阻止SK-Mel-103细胞迁移

采用Transwell 迁移实验研究HEP-14对SK-Mel-103细胞迁移能力的影响(图4A)，结果表明HEP-14显著抑制了细胞迁移(P<0.05)。为了探讨HEP-14对黑色素瘤细胞SK-Mel-103的迁移抑制作用是否与下调 CD271表达相关，通过RT-qPCR、Western blot验证后(图4B～E)发现 HEP-14处理SK-Mel-103细胞 72h能显著抑制CD271的表达，同时，用细胞免疫荧光染色分析HEP-14处理后CD271在SK-Mel-103细胞内的表达(图5)，结果显示，与对照组相比，10 μmol/L HEP-14组CD271的荧光信号明显减弱(P<0.05)；为进一步探讨HEP-14对CD271的抑制作用是否依赖STAT3信号通路的调控，RT-qPCR、Western blot结果显示，HEP-14能显著抑制STAT3磷酸化，并且成一定的浓度依赖性(P<0.05，P<0.01)；这一结果在其他黑色素瘤细胞株SK-MEL-147和SK-MEL-28也得到了验证(图6)。上述结果表明，天然小分子HEP-14可能通过STAT3依赖的信号通路调控黑色素瘤细胞的CD271表达，抑制黑色素瘤细胞的转移。

A：Transwell检测10 μmol/L HEP-14对黑色素瘤细胞SK-MEL-103迁移的影响；B、C：CD271和STAT3的mRNA相对表达；D、E：CD271、p-STAT3、STAT3的蛋白相对表达 a: P<0.05，b:P<0.01，与空白对照组(0 μmol /L)组比较

图5 免疫荧光检测10 μmol/L HEP-14对黑色素瘤中CD271表达的影响

A、B：分别为HEP-14处理后SK-MEL-147、SK-MEL-28中STAT3和CD271的mRNA相对表达量；C、D：HEP-14处理后SK-Mel-147细胞CD271、p-STAT3、STAT3蛋白的相对表达；E、F：HEP-14处理后SK-Mel-28细胞CD271、p-STAT3、STAT3蛋白的相对表达 a: P<0.05，b:P<0.01，与空白对照组(0 μmol /L) 组比较

3 讨论

黑色素瘤是由正常黑色素细胞异常转化引起的恶性肿瘤，具有高度侵袭性和转移性，其发病率在全球范围内逐年攀升。黑色素瘤细胞的异质性及治疗过程中癌基因和信号通路再次激活，已成为阻碍恶性黑色素瘤药物治疗的主要障碍，也使黑色素瘤的药物研发面临新的挑战。天然小分子已成为多种癌症治疗的手段之一，本研究探讨了天然小分子HEP-14对高恶性黑色素瘤SK-Mel-103细胞的抑制作用。本研究发现，HEP-14能显著降低黑色素瘤SK-Mel-103细胞活力、集落形成能力，增加细胞凋亡率，且表现出明显的浓度依赖性，表明HEP-14对黑色素瘤SK-Mel-103细胞的生长有明显的抑制作用。

STAT3是一种重要的转录因子，主要通过Tyr-705 位点的磷酸化而被激活，具有促进肿瘤的特性。在大多数人类癌症组织中存在持续的STAT3过度表达和/或STAT3的过度活化[24-25]。本研究结果表明，HEP-14可以抑制黑色素瘤细胞株包括SK-Mel-103、SK-MEL-147和SK-MEL-28的STAT3总蛋白的表达和磷酸化STAT3(Tyr-705)蛋白水平，说明HEP-14可能通过抑制STAT3信号发挥抗黑色素瘤作用。

CD271是黑色素瘤起始细胞标记物和重要的神经营养因子，调控黑色素瘤的成瘤性和迁移能力，是黑色素瘤发展进程中的重要调控因子。本研究通过GEPIA数据库对STAT3基因与CD271基因(NGFR)进行相关性分析，发现在黑色素瘤组织中CD271与STAT3在转录组水平上的表达呈正相关。有研究报道在高表达CD271的黑色素瘤转移病灶中，同时检测到被高度激活的STAT3[15-16,18]，其依赖的信号通路在介导黑色素瘤细胞向肺部、大脑转移的过程中同样起到关键的调控作用[19]；提示黑色素瘤中CD271的表达可能与STAT3依赖的信号通路调控相关。在进一步研究中发现HEP-14在抑制STAT3磷酸化的同时也抑制CD271的表达，提示HEP-14可能是通过调控STAT3通路活化抑制CD271的表达，从而抑制SK-Mel-103细胞的迁移。无论HEP-14是否直接抑制黑色素瘤起始细胞亚群，本研究结果提示HEP-14可能成为STAT3抑制剂或作为CD271上下游基因的调控剂。天然小分子HEP-14对黑色素瘤的抑制作用具有潜在的研究意义，将为恶性黑色素瘤寻找新的治疗途径提供思路。

综上所述，天然小分子HEP-14能有效抑制黑色素瘤细胞生长和诱导其凋亡；可能通过抑制STAT3的激活下调CD271的表达，从而抑制黑色素瘤细胞的迁移。但诱导细胞死亡存在多种途径，也可能同时受到多条信号通路的调控，HEP-14抑制黑色素瘤细胞生长的明确机制还需要进一步的研究。CD271作为重要的神经营养因子参与了细胞的增殖、迁移、细胞粘附等多种细胞生物学行为，因此也受到多种信号通路的调控。CD271是受到STAT3通路的直接调控，还是通过多条信号通路的交叉调控而发挥作用，仍需要进一步研究。