小胶质细胞介导的突触修剪在慢性脑缺血中的作用及其机制

汤诗怡 赖梅菁 邱美茜 詹丽璇

广州医科大学附属第二医院神经内科，广州医科大学神经科学研究所（广州 510260）

慢性脑缺血又称慢性脑低灌注，是一组因持续的脑血流灌注减少所致的慢性脑功能障碍综合征，是导致血管性认知功能障碍的主要原因之一[1]。近年来，研究表明，慢性脑缺血导致的认知功能障碍与突触异常丢失有关[2]。突触是神经元之间信息传递的关键组件，是组成神经回路、产生认知记忆的基础[3]。研究证实，在正常大脑发育过程中，小胶质细胞会选择性地吞噬部分多余的神经联系，使保留下来的功能性突触相互连接，形成精确的神经环路，这种小胶质细胞选择性消除突触的现象被称为突触修剪[4]。当小胶质细胞的吞噬功能受损或异常激活时，突触修剪异常，导致突触的异常堆积或过度丢失，从而诱发或加重神经系统的退行性病变[5]。已有报道证实，在慢性脑缺血中，认知功能的下降除了与神经元受损引起的突触丢失有关以外，小胶质细胞通过多种分子机制介导的异常突触修剪也发挥重要作用[5-7]。本文将就小胶质细胞介导的突触修剪在慢性脑缺血中的作用及其分子机制进行综述。

1 慢性脑缺血后小胶质细胞介导的异常突触修剪

突触是神经元之间进行信息传递的重要结构。大脑在发育过程中，会产生受损或多余的突触，这些突触的选择性清除或修剪，有利于成年大脑塑造成熟的神经环路[4]。其中，小胶质细胞在突触修剪中发挥关键的作用。小胶质细胞是脑内固有的免疫细胞，也是抵御中枢神经系统损伤的重要防线。小胶质细胞不仅可分泌炎症因子，介导炎症反应，也能通过吞噬作用参与脑缺血后的神经损伤与修复[9]。一方面，小胶质细胞可通过选择性地吞噬受损的或不成熟的突触，维持突触及神经环路的稳定性，从而促进神经回路的发展[4]，该过程也被称为突触修剪，另一方面，小胶质细胞也可吞噬应激状态下存活的神经元和突触，导致缺血性脑损伤和神经功能缺损[9]，该过程属于异常的突触修剪。此外，当小胶质细胞吞噬突触减少，突触修剪异常，会造成突触异常堆积，从而使神经回路细化持续的缺陷。

目前，关于小胶质细胞异常吞噬突触的现象已经在多种神经系统疾病研究中得到证实，例如阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）、精神分裂症（schizophrenia，SCZ）和癫痫等。在AD早期，β-淀粉样（amyloid beta，Aβ）斑块尚未沉积于突触时，补体组分蛋白1q（complement component 1q，C1q）可定位于突触上，刺激小胶质细胞过度吞噬正常的突触，使AD早期即出现突触丢失[10]。在疾病后期，大量Aβ斑块沉积于突触上，激活补体级联信号通路，使小胶质细胞对突触过度吞噬和清除，最终导致认知功能障碍[11]。SELLGREN 等[12]发现，在SCZ患者皮层中，小胶质细胞过度吞噬兴奋性突触，导致兴奋性突触和抑制性突触比例失衡，从而引起认知功能障碍和思维障碍。类似地，在癫痫患者中，小胶质细胞过度吞噬抑制性突触，造成兴奋性突触和抑制性突触比例失衡，从而诱发癫痫[13]。然而，目前尚无直接证据表明慢性脑缺血后突触的损伤或丢失与小胶质细胞的异常修剪相关。有研究者使用经典的双侧颈总动脉永久性两血管闭塞（2-vessel occlusion，2-VO）制备大鼠慢性脑缺血模型，发现在双侧颈总动脉结扎后2周，海马CA1区和前额叶皮层活化的小胶质细胞向突触聚集，突触素（synaptophysin，SYN）和突触后致密蛋白-95（postsynaptic density protein 95，PSD-95）的表达降低，树突棘的密度明显减少[14-15]。SHI等[9]也发现，在小鼠一侧大脑中动脉闭塞后第14天，在皮层缺血中心区周围形成的胶质瘢痕中的星形胶质细胞和小胶质细胞，均可检测到SYN和PSD-95等突触成分，该现象在小胶质细胞中尤显著。当抑制吞噬相关受体后，小胶质细胞的吞噬功能受抑制，小鼠的脑损伤减轻，神经功能缺损改善。

突触异常丢失在许多神经系统疾病的早期阶段即可出现，且随着临床症状的进展而增加。但目前尚不清楚突触丢失是否会触发其他病理过程的发生发展，抑或只是对神经元损伤的潜在反应。尽管如此，突触异常丢失是许多神经损伤中的常见事件，与AD和其他疾病的认知功能障碍有关。因此提示脑缺血后海马区和前额叶突触的丢失可能与小胶质细胞对突触的异常吞噬有关，即过度活化的小胶质细胞可吞噬突触，导致突触异常丢失，引起认知功能下降。目前，关于小胶质细胞介导的突触修剪在慢性脑缺血中的作用及分子机制的相关研究较少。与AD、PD、SCZ和癫痫等神经系统疾病相比，突触修剪在慢性脑缺血中除了发生的脑区不同以外，相关的分子机制也可能不同。

2 慢性脑缺血后小胶质细胞介导的异常突触修剪的分子机制

小胶质细胞吞噬突触由多种分子机制介导，其过程大致可分为3步。首先，受损的突触释放C1q、补体3（complement 3，C3）和趋化因子 C-X3-C-基序配体 1（C-X3-C motif chemokine ligand 1，CX3CL1）等“找到我”信号，分别作用于小胶质细胞上的补体受体3（complement receptor 3，CR3）和C-X3-C-基序受体1（C-X3-C motif chemokine receptor 1，CX3CR1）等[16-19]，使小胶质细胞被募集到突触周围。继而，小胶质细胞受体和突触上的配体之间形成吞噬小体，该过程主要由“吃我”信号介导，例如磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）/髓系细胞2表达触发受体（triggering receptor expressed on myeloid cells 2，TREM2）和多重表皮生长因子样结构域蛋白10（multiple EGF like domains 10，MEGF10）、Mer酪氨酸激酶受体（tyrosine-protein kinase Mer，MERTK）等。相反地，突触还可释放“不要吃我”信号，如CD47和CD200，分别作用于小胶质细胞的CD47受体SIRPα和CD200R，对抗“吃我”信号，从而抑制小胶质细胞对突触的吞噬。最后，突触被小胶质细胞吞噬后消化分解。此外，星形胶质细胞也可以通过分泌相关的细胞因子，如白细胞介素（Interleukin-33，IL）-33和转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β等协同调节小胶质细胞吞噬突触[20]。

2.1 “找到我”信号

2.1.1 C1q/C3-C3R补体途径作为先天免疫系统的一部分，是目前在小胶质细胞对突触修剪的分子调节机制中研究较多的途径。C1q和C3是补体途径中重要的组成成分，C3通过补体经典途径和替代途径裂解成C3a聚集在突触表面，向吞噬细胞提供定位信号以供吞噬降解[16，19，21]。在大鼠视网膜发育模型中，C1q也可作为“找到我”信号，定位并标记在需要修剪的突触，供小胶质细胞上的C3R识别，进而介导小胶质细胞对突触的吞噬和修剪，完善视觉通路[22]。有研究表明，脑低灌注可诱导大鼠前额叶和海马齿状回的补体途径激活，这两个脑区C1q的表达显著增加，且小胶质细胞被激活、吞噬功能增强，进而加重了慢性脑缺血后的炎症和神经变性[14]。在大鼠2-VO后2～4周，纹状体中粘附和吞噬髓磷脂的反应性小胶质细胞数量增加，且伴随着补体C3及其受体C3aR的表达上调。给予C3aR拮抗剂SB290157后，慢性脑缺血大鼠纹状体中黏附于髓磷脂的小胶质细胞数量显著减少，白质损伤减轻，认知功能障碍改善[23]。上述研究表明，慢性脑缺血可能通过激活C1q/C3-C3R途径，促进小胶质细胞对突触的过度吞噬，加重脑白质损伤。

2.1.2 CX3CL1/CX3CR1CX3CL1又称Fractalkine，属于趋化因子CX3CL1家族成员之一，在海马神经元中高表达[24]，其受体CX3CR1则主要在小胶质细胞中表达。CX3CL1作为可溶性的“找到我”信号，定位于突触，趋化小胶质细胞向突触周围聚集，进而被小胶质细胞膜受体CX3CR1识别，诱导小胶质细胞吞噬突触，参与突触修剪过程[24，26]。当敲除cx3cr1基因后，慢性脑缺血小鼠海马CA1区和齿状回激活的小胶质细胞向突触趋化和聚集减少，海马CA1区的SYN和PSD-95表达较野生型大鼠增多，脑白质损伤和认知障碍减轻[25-27]，表明敲除cx3cr1基因可以抑制小胶质细胞对突触的过度吞噬，阻止突触的丢失。

虽然在动物或离体研究中，通过抑制上述“找到我”信号，可减少小胶质细胞对突触的异常吞噬，但目前在慢性脑缺血患者中，小胶质细胞吞噬突触的直接证据尚未得到证实，且仍未发现有明确的药物可通过抑制“找到我”信号，阻止小胶质细胞向突触靠近，减少异常的突触吞噬。有研究者在体外实验中使用米诺环素抑制小胶质细胞活化和增殖，能减少小胶质细胞对突触的吞噬[45]。米诺环素作为一种半合成的脑渗透性四环素抗生素，能否改善慢性脑缺血后的认知功能障碍，值得进一步的研究。

2.2 “吃我”信号：PS/TREM2“吃我”即吞噬信号的识别，是小胶质细胞受体与凋亡细胞膜配体之间形成吞噬小体。当小胶质细胞检测到突触表面暴露的“吃我”信号时，即迅速识别并吞噬这些突触。在这一过程中，PS/TREM2是大多数研究的关注点。

在细胞凋亡发生的早期，PS作为细胞凋亡早期的标记物，可从受损突触的局部质膜内侧转至细胞膜的表面，作为“吃我”信号被小胶质细胞的吞噬受体识别[28-29]，促使小胶质细胞靶向吞噬突触。表达于小胶质细胞中的吞噬受体众多，其中最受关注的是TREM2。TREM2是免疫球蛋白超家族的一种I型跨膜受体，作为“损伤感受器”，被暴露的PS直接识别，介导小胶质细胞吞噬突触[30]。SCOTT-HEWITT 等[29]发现，在海马神经元和小胶质细胞共培养中，无论是降低小胶质细胞的TREM2表达，还是使用膜联蛋白V阻断暴露的PS，均可抑制小胶质细胞对海马突触的吞噬，防止突触的过度丢失。此外，在AD模型小鼠中，病理性的Aβ聚集在突触上，诱发TREM2识别突触上暴露的PS，导致小胶质细胞对突触的过度吞噬[29]。慢性脑缺血后相关脑区神经元凋亡增多，受损神经元的突触可能也出现PS暴露，然而，降低TREM2的表达或阻断暴露的PS是否能保护突触免受小胶质细胞的吞噬，目前尚未发现相关文献报道。值得思考的是，当阻断所有暴露的PS时，是否会影响凋亡细胞的正常清除，从而减弱小胶质细胞对内环境的监视作用，加重慢性脑缺血的白质损伤。

2.3 “不要吃我”信号：CD47-SIRPα和CD200/CD200R为了完成吞噬，小胶质细胞不仅要识别突触上的“吃我”信号，可能还需抑制突触表面的“不要吃我”信号，如CD47和CD200等[31]。神经细胞膜上的CD47信号通过其表达在小胶质细胞上的受体SIRPα，抑制小胶质细胞对突触的吞噬，而缺乏这两种蛋白的小鼠则表现出过度的小胶质细胞吞噬，导致背外侧膝状体突触的丢失[32]。除CD47-SIRPα外，CD200/CD200R途径是目前研究小胶质细胞介导突触修剪的另一种“不要吃我”信号。CD200表达于神经元表面，CD200R则由小胶质细胞表达[33]。在与存在Aβ斑块的野生型小鼠相比，cd200基因敲除小鼠吞噬Aβ蛋白的能力增加[34]。通过表达这些“不要吃我”的信号，神经元可阻止小胶质细胞对学习和记忆有贡献的突触的吞噬。然而，目前关于“不要吃我”信号在慢性脑缺血中的研究仍然缺乏，所以CD47-SIRPα和CD200/CD200R信号是否参与调控慢性脑缺血后小胶质细胞对突触的修剪，值得进一步的研究。

2.4 星形胶质细胞协同作用星形胶质细胞为神经元的生长提供营养支持，并在中枢神经系统发育过程中参与突触修剪。它不仅可以作为吞噬细胞，通过两种表达于其表面的吞噬受体MEGF10和MERTK介导神经突触的修剪，还可通过释放IL-33和TGF-β等细胞因子，参与小胶质细胞的突触修剪，在脑的正常发育和病理过程中都起着重要作用。

研究表明，星形胶质细胞上的MEGF10和MERTK吞噬受体通过识别靶标碎片发出的PS等“吃我信号”来启动吞噬过程。当敲除megf10或mertk基因使星形胶质细胞MEGF10或MERTK表达降低时，小鼠因突触修剪缺陷，而表现视觉通路发育障碍。有研究还显示，在急性脑卒中后的亚急性期，梗死区周围的胶质瘢痕处，MEGF10和MERTK蛋白表达升高，星形胶质细胞过度吞噬突触，阻碍了突触再生和神经修复[9]。

IL-33是IL-1家族细胞因子之一，主要由星形胶质细胞产生和分泌，进而与表达于小胶质细胞的受体白介素1受体样蛋白1（interleukin 1 receptor like 1，IL1RL1）结合，促进小胶质细胞对突触的吞噬，参与中枢神经系统的发育过程。IL-33也表达于成年海马的神经细胞中，并以一种神经元活动依赖的方式调节海马突触修剪。当沉默IL-33或IL1RL1后，神经连接会因突触吞噬降低而发生整合障碍[35]。同样地，在AD小鼠模型中，当降低IL-33的表达或敲除il1rl1基因时，小胶质细胞对突触的吞噬受抑制，最终导致过量的突触堆积[36]。

TGF-β对维持小胶质细胞的静息状态至关重要。TGF-β包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3三种亚型。不同亚型的TGF-β在突触修剪中发挥不同的作用。研究表明，在Aβ寡聚体诱导的AD小鼠模型中，星形胶质细胞分泌的TGF-β1能够抑制小胶质细胞过度吞噬导致的海马CA1区突触丢失。体外实验证实，当增加培养基中的TGF-β2和TGF-β3，会导致海马神经元PSD95的表达减少[37]。其中，TGF-β3还可诱导海马神经元C1q的表达上调，后者通过与小胶质细胞上的CR3来介导突触修剪。上述研究表明，星形胶质细胞在调控小胶质细胞修剪突触的过程中，可通过分泌不同亚型的TGF-β，发挥不同的作用。其中，TGF-β1具有保护突触的作用，而TGF-β2和TGF-β3则可促进小胶质细胞对突触的修剪。

总之，星形胶质细胞分泌的IL-33和TGF-β能作为细胞因子参与小胶质细胞介导的突触修剪，但在慢性脑缺血中鲜有报道。抑制星形胶质细胞分泌的这些细胞因子，可能为减轻慢性脑缺血后小胶质细胞的异常吞噬提供可能性。小胶质细胞和星形胶质细胞之间的通讯在多大程度上调节不同病理情况下的突触修剪，也将是未来研究的一个重要领域。

3 总结与展望

吞噬信号在多种神经系统疾病中可调节小胶质细胞对突触的吞噬作用，阻断这些信号传导可能阻止小胶质细胞对突触的过度吞噬而产生有益结果。现有证据表明，补体C3/C1q/C3R和趋化因子CX3CL1/CX3CR1信号通路等可能参与慢性脑缺血后小胶质细胞介导的突触修剪，但这些信号通路介导的小胶质细胞对突触的修剪在慢性脑缺血进展过程的各阶段发挥的作用以及其对疾病的发展产生的长期作用等问题仍悬而未决。STOKHOLM等通过正电子发射型计算机断层显像（Positron Emission Computed Tomography，PET）检测发现，在早期的帕金森病患者，黑质中小胶质细胞大量激活，纹状体多巴胺能神经投射功能降低[38]。鉴于慢性脑缺血与AD和多发性硬化等疾病的部分病理改变相似，能否通过PET检测小胶质细胞吞噬突触作为慢性脑缺血患者早期诊断的手段之一，值得进一步的研究。此外，米诺环素或补体抑制剂等针对小胶质细胞吞噬作用的研究与临床实验，可能为慢性脑缺血患者突触损伤引起的认知功能障碍的早期治疗提供新理论。