山楂主要成分提取分离及检测分析研究进展

李春峰， 赵子璇， 刘桂艳

(北京理工大学生命学院分子医学与生物治疗重点实验室，北京 100081)

蔷薇科山楂属植物在全世界现有一千多个物种，主要分布于北半球的温带地域，中国是山楂重要的发源地之一，现有山楂品种20个，变种7个，变型1个[1]。2020年版《中国药典》收载的山楂和山楂叶，均为山楂属的2个种山里红CralaeguspinnatifidaBge.Var.majorN.E.Br.和山楂CralaeguspinnatifidaBeg.的植物来源[2]。山楂主要分布于在华北区的河北、山西、内蒙古，西北区的陕西、青海、新疆，东北三省以及华东和华中的部分省的半山地域[1]。作为山楂道地药材产地的河北省兴隆县被林业部命名为“中国山楂之乡”，山楂种植面积和产量居全国之首[3]。

山楂早在《本草经集注》中就有记载，其性微、温，味酸、甘，归胃、脾、肝经，具有消食健胃、化浊降脂、行气散瘀、收敛止痢等功效[4]，临床上主要用于治疗食欲不振、高血脂和高血压等疾病[5]。山楂叶在东晋《肘后方》中有记载，茎叶煮汁洗漆疮，后两代本草均有记载。黄酮类和三萜类化合物是山楂的活性成分，此外山楂中还含有苯丙素类、甾体类、有机酸类、有机胺类和其他营养物质等[5-6]。现代药理研究表明，山楂果、叶和种子的提取物具有调节血脂、抗动脉粥样硬化、抗心力衰竭、降血压、抑菌、抗病毒、抗肿瘤等作用[6]。本文对山楂中的黄酮类、三萜类成分的提取分离及检测分析方法进行综述，以期为山楂资源的进一步研究和开发利用提供参考。

1 黄酮类化合物

山楂中黄酮类化合物有6类，包括黄酮类(如牡荆素、荭草素等)、黄酮醇类(如槲皮素、金丝桃苷、芦丁等)、二氢黄酮类(如柚皮素、北美圣草素及其苷等)、二氢黄酮醇类(如花旗松素及其苷等)、黄烷3-醇类(如儿茶素、白矢车菊等)、前花青素类(即黄烷聚合物类，如原花青素A2和原花青素B2等)[7]。山楂黄酮具有抗氧化应激、抗肿瘤、抗心肌缺血、抗慢性心力衰竭等作用[6]，在药物研究和保健品开发方面极具潜力。提取分离山楂黄酮类成分为研究和开发其药品和保健品提供有效的物质基础。

1.1 提取方法

1.1.1 传统提取方法 传统的提取方法中既有不加热的浸渍法、渗滤法，也有通过加热提高提取率的煎煮法、回流法、连续回流法(也称索氏提取法)等[8]。煎煮法相对于其他传统提取方法虽然经济、安全、简便，但不适于提取不易溶于水或水煎煮易破坏的成分。单味药山楂用煎煮法提取也有报道，张黎明等[9]用水煎煮法提取山楂叶总黄酮，折算提取总黄酮含量占药材的2.19%。浸渍法和渗滤法用水或不同比例的有机溶剂(主要是乙醇)作溶剂，不加热或低温加热，适于遇热不稳定成分的提取，缺点耗时长、溶剂多、易变质。从提取效率上看渗滤法高于浸渍法[10-12]。回流法由于提取溶剂大多为有机溶剂，且温度比煎煮法低，是研究最多也是目前制药企业常用的方法。张明[12]对比浸渍法、回流法、渗漉法提取山楂总黄酮效果，结果显示，使用70%乙醇提取时，总黄酮提取率回流法高于渗漉法和浸渍法；使用50%乙醇提取时，渗漉法总黄酮提取率高于回流法和浸渍法，且回流法液料比最小。连续回流提取法溶剂用量少，但是规模小，不适于工业化生产，是实验室常用的提取方法之一。需要注意的是，连续回流长时间高温加热会破坏成分，不适于提取高温不稳定的成分。

1.1.2 新型提取方法 近年来，提取方法中既有通过改变仪器设备而改变提取方式的，如超临界流体萃取、超声波辅助提取、微波辅助提取[8]、超高压提取、快速溶剂提取、闪式提取等，也有通过添加化学成分增加提取率的提取方法，如添加表面活性剂、添加酶液等。超声波辅助提取对于山楂果、叶和核的研究均有报道，但是优化后的工艺差别较大，提取率差别也很大，山楂果总黄酮提取率在6.21%～11.31%之间[13-14]。超声联合回流提取山楂核总黄酮，提取率(1.65%)是单独回流提取的1.32倍[15]。超临界流体萃取法具有选择性，对于热不稳定和弱极性成分具有很好的分离效果。如果用CO2作介质提取极性较大的成分需添加夹带剂如乙醇、丙酮等。胡凯等[16]和刘庆文[17]分别采用极性亚临界流体1,1,1,2-四氟乙烷(R134a)和超声联合CO2超临界流体法萃取山楂果中的原花青素，提取率分别为2.50%、13.20%。微波法因具有加热迅速、膜破坏完全、能量损失少等特点在山楂中也有研究报道。李敏等[18]和Luo等[19]分别对山楂果和山楂叶采用微波法和微波辅助酸水解法提取其中的黄酮类成分，提取率、得率分别为13.42%、2.62 mg/g。闪式提取法相对于其他提取方法最突出特点是提取时间短、速度快，但是存在规模小等缺点。杨燕新等[20]通过闪式提取法提取山楂核中的黄酮类成分，总黄酮提取率为0.64%。超高压提取技术因其提取时间短、溶剂消耗少、低温节能和效率高等特点受到人们的关注。孙协军等[21]和周志强等[22]通过超高压法分别对山楂果和山楂叶中黄酮类成分进行提取，山楂果中3个黄酮类化合物(槲皮素、芦丁和金丝桃苷)的总提取率和山楂叶中总黄酮的提取率分别为0.055%、7.068%。骆晓沛等[23]优化超高压提取、索氏提取、超声波辅助提取、微波辅助提取的工艺，结果显示，山楂果中总黄酮提取率分别在最优工艺参数条件下依次为5.44%、5.12%、4.66%、3.76%。相对于其他3种方法，超高压提取法保留了浸渍法的优点，具有温度低、提取杂质少、提取率高、成本较低等特点。快速溶剂提取法虽然提取速率快、时间短，但是降解热是需要关注的问题。曹会凯[24]通过对快速溶剂提取法、超临界萃取法和微波法提取山楂果中黄酮类成分工艺的考察得出，3种方法的提取率依次为4.99%、3.80%、3.64%，结果显示，快速溶剂提取法相比于其他2种方法具有提取率高、时间短和操作简便等优点，适于工业化生产。生物酶法与传统的提取技术相比，可以避免高温条件下对活性物质的破坏，对提取物质起到保护作用。高文秀等[25]对不同酶解协同超声波辅助提取山楂果中总黄酮的工艺进行研究发现，纤维素酶解协同超声提取的总黄酮提取率(8.48%)比单独超声法和单独用酶解法的提取率分别提高了29.5%、13.2%。表面活性剂提取法也是一种有效的提取方法。Han等[26]发现用添加表面活性剂的超声提取法提取山楂中牡荆素等黄酮类化合物可以获得较高的提取率。潘芳芳等[27]考察表面活性剂提取法和热回流法提取山楂果中黄酮类成分的工艺，表面活性剂辅助法提取总黄酮的提取率(4.55%)相比传统的乙醇回流法的提取率(3.78%)增加了16.97%，该方法一方面保留了热回流提取法的优点，另一方面表面活性剂的使用增加了提取速率，在相同的提取条件下该方法可以提高提取率，节约时间和资源，但是对于不同提取物的表面活性剂的选取还需要有一定的经验。

1.2 分离方法

1.2.1 常用分离方法 在山楂黄酮类化合物的常用分离纯化方法中有因溶解度不同而实现分离的沉淀法和萃取法；也有因填料不同的大孔吸附树脂、聚酰胺、硅胶、葡聚糖凝胶等常压柱色谱法(也叫柱层析法)以及硅胶中压和C18高压制备液相色谱法等[8]。色谱法在山楂的分离纯化中使用较多，可根据化合物的极性大小、是否含有羰基和羟基、分子大小和带电荷的不同从而选择不同的填充剂进行分离[8]。大孔吸附树脂是氢键或范德华引力吸附和分子筛共同作用[8]，而且连续使用性能稳定，不需要经常再生，已广泛用于制药企业工业化生产中，是分离纯化山楂总黄酮或原花青素类成分使用最多的色谱分离方法。赵立辉[28]使用柱层析法考察4种大孔吸附树脂(AB-8、FL-1、FL-2、FL-3)和聚酰胺对山楂果中黄酮类化合物的纯化性能，结果表明，AB-8、FL-3树脂纯化后样品纯度分别为86.6%、85.0%，加样回收率分别为85.0%、80.0%，具有较好的纯化效果。张黎明等[9]和宋小锋等[29]都使用D101大孔吸附树脂分离纯化山楂叶提取液中的总黄酮，纯度均在82%以上。刘丽南等[10]使用HPD826 氢键型树脂纯化，制备的提取物中10种原花青素成分总含量占干重的42%。祝波等[30]使用D101大孔吸附树脂分离纯化山楂果提取液中的原花青素，原花青素B2的纯度从7.42%提高到34.39%。聚酰胺吸附量相对较大，分离效果好，但其洗脱速度较慢，且不能多次重复使用。张伟等[31]对复方山楂提取物中总黄酮的分离纯化工艺进行研究，发现使用聚酰胺树脂分离纯化后的总黄酮纯度可达到80.1%，纯化物中总黄酮保留率高达93.0%。葡聚糖凝胶主要依靠分子筛作用，适用于初步分离后进一步纯化黄酮类化合物的过程。马娟娟[32]对葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱分离纯化山楂叶粗黄酮粉末的方法进行研究，结果显示，40%乙醇洗脱得到3个组分，组分1～2合并总黄酮纯度以及组分3的总黄酮纯度分别为83.27%、94.27%。上述常压色谱分离法具有易操作，不需要昂贵设备等优点，常被用于化合物的组分分离，但是常压色谱分离时间较长，分离单一化合物效果不理想。在分离纯化单一化合物时，常采用中压、高压制备液相色谱或薄层制备色谱等几种技术联合使用。李晶等[33]联合应用硅胶层析、葡聚糖凝胶(SephadexLH-20)常压柱色谱和反相制备高压液相色谱(RP-Pre-HPLC)从山楂果实中分离出1个新化合物。

1.2.2 新型分离方法 相比于传统的分离方法，近年发展起来的新型分离纯化方法如高速逆流色谱、膜分离[8]和分子印迹等方法因具有操作时间短、制备量大、纯度高等特点而受到人们的关注。高速逆流色谱法和膜分离技术都具有分离效率高、操作简单等特点，前者在分离时样品负载能力强、制备量大、重现性好，而后者在分离时不损害物质活性、分离效率高、能耗低、无污染并且可连续生产。分子印迹法因具有预定性、专一识别性、高度的稳定性和较长的使用寿命而受到人们关注。刘妧晨等[34]采用索氏提取联用分子印迹分离技术研究山楂中槲皮素的提取和分离同步进行的方法，结果显示，槲皮素的提取率(0.033 mg/g)是常规索氏提取效率的15倍，但分子印迹萃取法因过程较复杂、外加成分多、成本高等原因还未能推广使用。对于难分离的物质例如同分异构体需要几种方法联合使用以得到理想的分离效果，例如联合应用高速逆流色谱法(HSCCC)与制备液相分离法分离山楂黄酮类成分，分离出的黄酮化合物(儿茶素、牡荆素等7个)的纯度超过98%[35]。

1.3 检测分析方法

1.3.1 常用检测分析方法 化学成分的检测分析主要包括定性和定量2个方面。薄层色谱(TLC)和高效液相色谱(HPLC)或高效气相色谱(HPGC)是最常用的定性和定量检测方法。对混合物中已知化合物进行定性时需要对照品比对，TLC和HPLC或HPGC因其具有灵敏度高、精确度高、操作简便和适用范围广等特点被广泛应用于化学成分的定性检测分析中。对于分离纯化得到的单一未知化合物确定结构常用的方法是1H和13C的一维或二维的核磁共振波谱(1H-NMR、13C-NMR)、不同质核比的质谱(MS)、伸缩或弯曲振动的红外光谱(IR)和电子跃迁的紫外(UV)光谱等联合应用确定化合物结构。李晶等[33]从山楂叶中提取分离纯化得到1个化合物，采用HR-ESI-MS、IR和1H-NMR、13C-NMR的一维和二维谱等多种检测方法，确定化合物的结构式，为新化合物，命名为2′-羟基-7-(3-羟丙基)-6-甲氧基-黄酮。TLC和HPLC或HPGC也是常用的定量检测法，测定混合物中某些化合物的含量需要用某些化合物作为对照品，并以对照品的不同浓度作标准曲线，以测定混合物中化合物的含量。TLC法具有操作简单，分析速度快，样品用量少，可同时测定多个样品等优点，但是定量的精确度不高。HPLC法因其灵敏度高、准确度高等优点，是测定山楂中黄酮类化合物最常用的定量方法。黄怡等[36]建立了HPLC同时测定山楂叶提取物中牡荆素-2″-O-鼠李糖苷、金丝桃苷、槲皮素、山柰酚的含量，结果表明，HPLC法具有较高的精确度和灵敏度。胡玉等[37]以非离子表面活性剂、胶束萃取-浊点预富集与超声萃取技术结合HPLC法测定山楂果中的芹菜素等9种成分含量，该方法简便快速，环境友好，准确度高。目前对于定量测定混合物中某类成分总的含量最常使用的是紫外-可见分光光度法(UV-VIS)，虽然该方法不能准确定量某类成分的真实含量，但是因其简便快速，仍然是山楂中总黄酮含量测定最常用的方法。张文莉等[38]以芦丁为对照，采用2种显色系统NaNO2-AI(NO3)3-NaOH和A1C13，用紫外-可见分光光度法对山楂叶提取物中总黄酮含量进行测定和比较分析，2种显色法测定的结果偏差较大，该方法的精确性和准确度在混合物含量测定方面还需改进和完善。

1.3.2 新型检测分析方法 为了快速检测混合物中的化学成分，超高效液相色谱(UPLC)因其检测速度和分离度均优于传统的HPLC而备受青睐。但若使用不当，色谱柱很容易堵塞。液-质连用的分析技术(HPLC-MS)，检测前不需要对样品进行特殊的前处理，具有灵敏度高、检测速度快、操作简便等优点，该方法定性和定量检测能同时进行[24]。Zhang等[39]建立超高效液相色谱与电喷雾电离串联质谱(UPLC-ESI-MS/MS)联用的方法，通过该方法分离测定山楂叶中牡荆素-4″-O-葡萄糖苷等4种黄酮类化合物，与HPLC法相比，该方法不一定需要对照品比对也能检测鉴别混合物中化合物的结构，但是仪器相对昂贵，通常需要专业人员进行操作和维修，成本较高。

2 三萜类化合物

山楂中的五环三萜化合物有3种类型，包括乌苏烷型(熊果酸、科罗索酸等)、齐墩果烷型(如山楂酸、齐墩果酸等)、羽扇豆烷型(如白桦酯酸)；四环三萜类化合物主要有环阿屯烷型(如环阿屯)、羊毛脂烷型(如牛油树醇、24-亚甲基-24-二氢羊毛脂甾醇等)[7]。目前，三萜酸(五环三萜)是山楂中三萜类成分研究的主要对象，如山楂酸、熊果酸、科罗索酸、白桦酯酸和齐墩果酸等，因其具有一定的抗病毒[6]和抗糖尿病[40]等重要药理作用而受到研究者的关注。

2.1 提取方法

2.1.1 传统提取法 热回流法也是较多地应用于山楂中三萜类成分的提取。吕丹等[41]采用热回流法提取山楂果皮中的三萜类化合物，提取率为1.98%(即提取总三萜占山楂果皮中的含量)，并且实现同步提取多酚和黄酮类成分，既节约成本，又避免资源浪费。陈宝龙等[42]通过比较95%乙醇回流法、碱醇水浸提法、60%乙醇回流法和碱水超声法提取山楂果中三萜酸(齐墩果酸和熊果酸)，结果发现，齐墩果酸和熊果酸在前2种方法的剩余残渣中均未被检测到，表明提取较为完全，而在后2种提取方法残渣中均被检测到，表明未提取完全。结合实际生产情况，碱醇水浸提法提取效率高、成本低、安全、易于规模化，故选取碱醇水溶液浸提法为最终方案。

2.1.2 新型提取方法 在近年发展起来的提取方法中，超声波辅助提取对于提取山楂果和果皮中的三萜类化合物均有报道，其中冻融-超声提取法提取山楂果中三萜酸和超声提取法提取山楂果皮渣中三萜酸的提取率分别为3.41%[43]、2.33%[44]。微波提取法较多研究于山楂核和果中的三萜类化合物提取，通过在最佳提取工艺条件下比较可以发现，山楂果中三萜酸的含量(提取率3.42%)高于核中三萜酸的含量(提取率1.14%)[45-46]。植奇明[47]选择95%乙醇作为超临界流体萃取山楂中总三萜的夹带剂可以获得较高的提取率。协同提取是在较短时间、溶剂消耗少的情况下可获得较高提取率。寇云云[48]通过考察微波辅助提取、热回流提取和超临界流体萃取山楂总三萜的工艺研究，得到采用单一提取方法提取山楂总三萜的提取率依次为4.08%、2.57%、0.97%，但3种方法协同提取(超临界-回流-微波)获得的提取得率可高达5.13%，结果表明，相对于单一的提取方法，将各个方法的优点结合在一起进行协同提取是一种有效的提取方法，也为新型提取技术的发展提供了借鉴。相对于传统的提取方法，近年发展起来的方法普遍具有提取效率高、时间短和得率高等优点，但是这些方法由于成本普遍较高，使用中仪器易出现故障，若进行工业化生产还需要针对以上问题进行不断地改进和完善。

2.2 分离方法 重结晶法、大孔吸附树脂层析法是分离纯化山楂中三萜类成分常用的方法。黄超华等[49]使用重结晶法从山楂果中分离纯化得到纯度较高的熊果酸。袁怀波等[50]采用AB-8大孔吸附树脂串联柱分离山楂果中的三萜酸，用70%乙醇洗脱得到总三萜酸洗脱率和纯度分别为79.02%、29.02%。柱层析法是分离山楂三萜类化合物常用的技术，然而单一的方法不能有效的分离纯化，常需要结合其他方法连续分离以提高分离效率。陈宝龙等[42]通过比较3种纯化山楂三萜酸中有效成分的方法，结果表明，齐墩果酸和熊果酸用大孔树脂纯化后的纯度在50%以下，活性炭吸附纯化后的2种三萜酸纯度较高为59.04%，而活性炭吸附联合结晶纯化后的2种三萜酸纯度大于70%，并且不会导致三萜酸的损失，是山楂中三萜酸纯化分离的理想方法。目前分离纯化山楂中单一化合物最有效的方法仍然是制备液相色谱，对于较难分离的化合物能够起到很好的分离效果。Qiao等[51]将该方法与柱层析法联合使用可以快速、有效地从山楂果中分离鉴定15种三萜酸类成分。

2.3 分析检测方法

2.3.1 常用检测分析方法 分光光度法和高效液相色谱法是检测三萜类成分常用的方法，前者是基于三萜苷元和香草醛-冰醋酸-高氯酸显色的颜色反应，是一种快速、简单的测定总三萜类成分的方法；后者在三萜类化合物检测分析中广泛应用，具有检测精度高、分析速度快等优点。黎海衫[52]采用90%乙醇热回流提取和AB-8大孔吸附树脂分离山楂果中的熊果酸，HPLC法测定熊果酸含量，熊果酸浸出率1.07%，纯度97.0%，回收率大于98.1%。林科等[53]将山楂果中熊果酸用乙醇浸提，浓缩后的沉淀用碱水溶解酸水沉淀得熊果酸粗品，再通过大孔吸附树脂进行分离，纯化后的熊果酸用分光光度法测定纯度达到90%。李建中[54]采用可变波长高效液相色谱建立三萜类化合物含量测定方法，在该方法下检测山楂中的三萜类化合物熊果酸和齐墩果酸不但能够得到较好的分离效果，而且还具有精度高、快速准确和操作简单的特点。采用红外光谱、核磁共振波谱和质谱等也是山楂中三萜类化合物鉴定结构常用的方法。黄超华等[49]通过薄层色谱法和红外光谱法对山楂提取物中的有效成分进行分析和鉴定，最终确定是三萜类物质熊果酸。宋少江等[55]对55%乙醇水洗脱部分进行分离纯化后，采用IR和NMR法进行结构分析与鉴定，最终确定熊果酸等5个化合物。Zhou等[56]对70%乙醇回流提取部分分离纯化后，采用NMR和HR-ESI-MS等方法鉴定得到1个新的倍半萜。

2.3.2 新型检测分析方法 液质联用等新型检测分析技术的应用，对于山楂中三萜类化合物的研究具有重要意义。许红蕾等[57]采用液相色谱-二极管阵列光谱检测/电喷雾离子化质谱(HPLC-DAD/ESI-MS)联用技术从山楂叶提取物中鉴定得到11个化合物。岳晓芝[58]采用HPLC/ESI-IT-MS法和乔晓莉等[59]采用超高液相/电喷雾-飞行时间/质谱(UPLC/ESI-TOF/MS)法分别从山楂中分析鉴定出了12、13个化合物。马志良等[60]采用柱前衍生高效液相色谱-荧光检测/质谱联用法(HPLC/FLD-APCI/MS)同时测定6种三萜酸的含量。在山楂三萜类化合物的检测与分析方法中，随着检测分析技术不断发展，由测定单一成分的薄层色谱法以及红外光谱法逐渐发展成为同时测定多种化合物的液相色谱和电喷雾离子化质谱(HPLC-DAD/ESI-MS)联用技术，该检测方法也将含量测定和结构鉴定结合到了一起，这些新技术的应用不但具有较高的精确度和准确性，而且操作简便、检测时间短，对于山楂有效成分的进一步研究和发展具有重要的推动意义。

3 展望

近年来，很多新的技术已被广泛地用于山楂有效成分的提取分离和检测分析中，获得了大量的研究成果，有力地推动了山楂中有效成分的深入研究和发展。在提取技术方面，新的提取方法如超声提取、微波提取和超临界萃取等都具有缩短提取时间、提高提取率等优点，但是新的提取技术仪器成本较高，仪器容易出现故障等问题还需要进一步的改进。而相对传统的提取方法热回流提取，由于该方法具有成本低，环保无污染，简便易行等一些优点依然是工业生产中常用的方法。在分离纯化方面，萃取法、沉淀法和柱色谱法等单独的分离技术还不能使化合物分离的纯度较高。将不同的分离纯化技术进行联合使用，可以实现有针对性的连续分离，能够极大地缩短分离时间，提高分离效率和纯度。在检测分析方面，对于总提物含量的测定大多使用分光光度法测定，通过标准品曲线进行含量计算，虽然该方法简便易行，短时高效，但是由于杂质和溶液本身对检测结果存在较大的干扰，该方法的准确性还有待进一步完善和提高。在对山楂有效成分的进一步研究和开发中，如何将传统的技术方法和新型的技术方法相结合，取长补短，协同创新，实现易行高效、经济节能和利于环保的技术应用于实际的科学研究和工业化生产中将是急需解决的主要问题。