高效液相色谱法测定保健食品中泛酸的不确定度评定
2022-12-17蔡良平刘光兰
蔡良平，刘光兰
汤臣倍健股份有限公司 (珠海 519040)
泛酸又名维生素B5，化学式为C9H17NO5，是一种水溶性维生素，因广泛存在于动植物中而得“泛酸”之名。由于所有的食物都含有维生素B5，所以几乎不存在缺乏问题[1,2]。泛酸几乎存在于所有活细胞中，且在其细胞内可以通过酶促反应合成。泛酸是体内柠檬酸循环、胆碱乙酰化、合成抗体等代谢所必需的中间物[3,4]。因此，泛酸在体内可作用于正常的上皮器官如神经、肾上腺、消化道及皮肤，提高动物对病原体的抵抗力[5]，维生素B5及其衍生物还可以减轻抗生素等药物引起的毒副作用，参与多种营养成分的吸收和利用[6-8]。
目前泛酸的检测方法主要有高效液相色谱法、微生物法、实脸动物法、放射免疫法[9-11]，本次研究则是使用高效液相色谱法，参照JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》[12]及JJG 196—2006《常用玻璃量器检定规程》，根据GB 5009.210—2016[13-15]对泛酸含量的检测，并对其各分量的不确定度进行评估。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
泛酸钙标准品(含量97.5%,扩展不确定度为1%)，SIGMA；乙腈(HPLC)，上海星可高纯溶剂有限公司；磷酸二氢钾(AR)，广东广试试剂科技有限公司；多种维生素片；一级水。
1260型高效液相色谱仪(附带紫外检测器)，安捷伦科技有限公司；色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，安捷伦科技有限公司；XP205型电子天平，梅特勒-托利仪器有限公司；ELMA P300H型超声波清洗器，德国ELMA。
1.2 方法
1.2.1仪器条件
色谱柱C18,柱长250 mm,内径4.6 mm,粒径5 μm。检测波长210 nm；流动相为0.02 mol/L磷酸二氢钾溶液∶乙腈=95∶5(v/v)；流速1.0 mL/min；柱温28 ℃±0.5 ℃；进样量10 μL。
1.2.2标准溶液配制
精密称取泛酸钙标准品10.27 mg至100 mL容量瓶中，在室温条件下，用水超声溶解，放至室温，定容至刻度，摇匀待用，浓度为0.099 41 mg /mL。
1.2.3供试品溶液配制
取适量以上试样研磨并混匀，精密称取0.5 g研磨均匀的样品，置于具塞锥形瓶中，加入适量的水超声提取20 min，摇匀，经0.45 μm的微孔滤膜过滤，为待测供试品溶液。
2.2.4数学模型的建立
试样中泛酸含量的计算如下：
X=V×C/M×0.92×K
式中：X为试样中泛酸含量，mg/100 g；M为样品质量,g；V为样品定容体积，mL；C为样品浓度，mg/mL；0.92为泛酸钙转换为泛酸的转换系数；K为为单位转换系数，取值100。
2 结果与讨论
2.1 不确定度各分量的来源与分析
依据全实验过程及图1所示的不确定度来源分析，主要有以下几个不确定度来源：试样重复性测定引入的不确定度ur(x1)；标准物质引入的标准不确定度ur(x2)；试样引入的标准不确定度ur(x3)；仪器(高效液相色谱仪)引入的标准不确定度ur(x4)；标准曲线拟合引入的标准不确定度ur(x5)。
图1 泛酸供试品含量测定的不确定度各分量直观图
根据试验实际情况，选用线性模型公式，计算相对不确定度，合成公式如下：
2.2 不确定度各分量的评估
2.2.1测量重复性引入不确定度的测定
按GB 5009.210—2016第二法对定值样品泛酸含量进行测定，重复测10次，测定结果见表1。此重复测量属于A类不确定度。
表1 多种维生素片样品中泛酸的含量重复测定10次结果
按贝赛尔公式计算出试验标准偏差为：
在实际检测过程中，测定供试品中泛酸含量2次时，取算术平均值为其检测结果，所以重复性测定引入标准不确定度为：
2.2.2标准物质引入标准不确定度的测定
3.3.2.1 标准物质含量本身引入的不确定度ur(x3.3.2.1)
3.3.2.2 标准物质在称量过程中引入的不确定度ur(x3.3.2.2)
3.3.2.3 标准溶液稀释和定容过程引起的不确定度ur(x3.3.2.3)
经分析评估，溶液定容主要引入的不确定度为：50 mL容量瓶(A级)。环境温度和玻璃容器对液体的体积有影响，会导致标准溶液在配制过程中的偏差。按均匀分布及最大允许误差来处理，K为包含因子，分别计算各分量的不确定度。
3.3.2.3.1 50 mL单标线容量瓶校准产生的标准不确定度ur(x3.3.2.3.1)
其相对标准不确定度：ur(x3.3.2.3.1)=0.028 8/50=0.000 576
3.3.2.3.2 校准温度、溶液温度之间的差异引入的标准不确定度ur(x3.3.2.3.2)
相对标准不确定度为：ur(x3.3.2.3.2)=0.261/50=0.005 21
50 mL A级单标线容量瓶的合成相对标准不确定度为：
由上面分析可得，泛酸标准物质引起的相对标准不确定度为：
3.3.3泛酸试样引入标准不确定度的测定
3.3.3.1 试样称量过程中引入的不确定度ur(x3.3.3.1)
样品称量时的相对不确定度为：ur(x3.3.3.1)= 0.000 029 g/0.5=0.000 058 g
3.3.3.2 样品定容引起的不确定度ur(x3.3.3.2)
溶液稀释过程引起的不确定度主要是50 mL容量引入的不确定度。
3.3.3.2.1 50 mL单标线容量瓶校准产生的标准不确定度ur(x3.3.3.2.1)
相对标准不确定度为：ur(x3.3.3.2.1)=0.028 9/50=0.000 576
3.3.3.2.2 校准温度、溶液温度之间的差异引入的标准不确定度ur(x3.3.3.2.2)
相对标准不确定度为：ur(x3.3.3.2.2)=0.261/50=0.005 21
50 mL容量瓶产生的合成相对标准不确定度：
由上面分析可得，泛酸样品引起的相对标准不确定度为：
3.3.4高效液相色谱仪引入不确定度的测定
高效液相色谱仪引入的不确定度分量评定ur(x3.3.4)
3.3.5标准曲线拟合产生不确定度的测定
表2 标准曲线信息
标准曲线信息见表2，线性方程为y=mx+b，即y= 4 009.929 26x+0.532 715，相关系数(R)为1.000 00。
标准曲线引入不确定的公式如下：
由标准曲线拟合引入的相对标准不确定度：
3.4 合成相对标准不确定度
各相对标准不确定度见表3。根据各分量引入的相对标准不确定度值，进行合成，则有：
表3 相对标准不确定度一览表
各测量不确定度的统计直方图如图2所示。
图2 各测量不确定度的统计直方图
试样测定平均值为388.9 mg/100 g，则泛酸测定的标准不确定度为ucr(x)=x×ur(x)=19.05×0.026=10.1 mg/100 g
3.5 扩展不确定度
取置信概率p=95%,k=2，扩展不确定度等于包含因子与合成标准不确定度的乘积，则泛酸含量的扩展不确定度U95=k×ucr(x) =0.052 mg/100 g。因此，本次测定的泛酸试样的平均含量为(388.9±20.2) mg/100 g
3 结论
从各测量不确定度的统计直方图可以看出，试样中泛酸含量测定引入的不确定度因素中，影响比较大的则是方法标准曲线拟合、重复性、标准溶液配制，影响较小的是样品和色谱仪本身所产生的不确定度。此结果与本实验操作过程是符合的，提示我们在使用此方法检测泛酸含量的过程中，需注意标准溶液的配制及标准曲线拟合，选用高级别容量瓶，同时还应该对我们的分析天平以及高效液相色谱仪进行定期的校准与维护保养。并要求检测人员熟练掌握方法要求各个步骤的操作，提高检测结果的准确性。
