HPLC法测定比卡鲁胺片的有关物质

2022-12-17毛联岗

化学工程师 2022年11期

毛联岗

（连云港杰瑞药业有限公司，江苏连云港 222006）

比卡鲁胺属于一种新型非甾体类抗雄激素药，可用于黄体生成素释放激素（LHRH）类似物或外科睾丸切除术联合应用于晚期前列腺癌的治疗[1,2]。目前，欧洲药典（EP）10.0版采用HPLC法测定比卡鲁胺原料药有关物质，但未列明其片剂的质量控制标准[3]，而美国药典（USP）43版所列检测方法对片剂的杂质分离效果一般，且检测灵敏度偏低，中国药典暂未收载该原料药和片剂的质量标准[4]。为保证药品的质量，并保障患者的用药安全，进行比卡鲁胺片的有关物质检测方法研究具有重要意义。基于参考文献所述方法[5-7]，本研究通过进一步优化流动相比例、柱温、检测波长等色谱条件，建立高效液相色谱（HPLC）测定比卡鲁胺片有关物质的分析方法，从而为相关产品的质量控制提供参考。

1 实验部分

1.1 试药信息

比卡鲁胺片（50mg·片-1阿斯利康制药有限公司）；杂质A（N-[4-氰基-3-（三氟甲基）苯基]-2-羟基-2-甲基-3-苯磺酰基丙酰胺）对照品（EP，纯度99.4%）；杂质B（N-[4-氰基-3-（三氟甲基）苯基]-3-[（2-氟苯基）磺酰基]-2-甲基丙酰胺）对照品（EP，纯度99.8%）；杂质C（N-[4-氰基-3-（三氟甲基）苯基]-3-[（4-氟苯基）磺酰基]-2-丙酰胺）对照品（EP，纯度98.8%）；杂质D（4-氰基-3-三氟甲基苯胺）对照品（EP，纯度99.9%）；杂质E（N-[4-氰基-3-（三氟甲基）苯基]-3-[（4-氟苯基）亚磺酰基]-2-羟基-2-甲基丙酰胺）对照品（EP，纯度97.1%）；比卡鲁胺对照品（EP，纯度99.5%）。

1.2 仪器与试剂

U3000型高效液相色谱仪（美国Thermo-Fisher公司）；MS204/A型分析天平（梅特勒-托利多有限公司）；CSH-111GD型光照试验箱（重庆创测科技有限公司）；101-2BS型电热恒温鼓风干燥箱（上海力辰仪器科技有限公司）。

HCl、NaOH、H2O2均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；三氟乙酸、乙腈，均为色谱纯，阿拉丁试剂有限公司；实验用水为超纯水。

1.3 色谱条件

采用Agilent Hypersil ODSC18色谱柱（100mm×4mm，3μm）；流动相A：0.01%三氟乙酸水溶液，流动相B：0.01%三氟乙酸乙腈溶液；梯度洗脱（0min、70%A，19min、70%A，29min、40%A，34min、40%A，36min、70%A，40min、70%A）；柱温：40℃；流速1.0mL·min-1；检测波长270nm；进样体积10μL。

1.4 溶液配制

稀释剂流动相A与流动相B的体积比为1∶2。

系统适用性溶液精密称取比卡鲁胺及其对照品适量（杂质A、B、C、D、E与比卡鲁胺质量比为1∶1∶1∶1∶1∶1000）置于一定体积的容量瓶中，加入稀释剂定容、摇匀，配制成比卡鲁胺浓度为1mg·mL-1的系统适用性溶液。

混合对照品溶液精密称取杂质A、B、C、D、E和比卡鲁胺适量(杂质A、B、C、D、E与比卡鲁胺质量比为1∶1∶1∶1∶1∶1）置于一定体积容量瓶中，加入稀释剂定容、摇匀，配制成比卡鲁胺浓度为1μg·mL-1的混合对照品溶液。

供试品溶液取比卡鲁胺片20片研细，精密称取适量置于一定体积的容量瓶中，加入稀释剂定容、摇匀，配制成比卡鲁胺浓度为1mg·mL-1供试品溶液，测定时取续滤液。

2 结果与讨论

2.1 系统适用性溶液

精密量取系统适用性溶液，照“1.3项”所述色谱条件，注入液相色谱仪，记录色谱图见图1。

图1 系统适用性溶液色谱图Fig.1 Chromatogram of system suitability solution

由图1可见，出峰顺序分别为杂质D、杂质E、杂质A、杂质B、比卡鲁胺、杂质C，各已知杂质与比鲁卡胺色谱峰之间的分离度均大于1.5，同时比卡鲁胺色谱峰理论塔板数大于5000，表明各色谱峰之间均能完全分离，系统适用性良好。

2.2 专属性试验

酸破坏称取比卡鲁胺片粉末（相当于比卡鲁胺20mg），置于20mL量瓶内，加入1mol·L-1HCl溶液2mL后，于40℃水浴中放置6h后，加入1mol·L-1NaOH溶液2mL后，加入稀释剂定容摇匀，即得酸破坏样品；

碱破坏称取比卡鲁胺片粉末(相当于比卡鲁胺20mg），置于20mL量瓶内，加入1mol·L-1NaOH溶液2mL后，于40℃水浴中放置6h后，加入1mol·L-1HCl溶液2mL后，加入稀释剂定容摇匀，即得碱破坏样品；

光照破坏称取比卡鲁胺片粉末（相当于比卡鲁胺20mg），置于20mL量瓶内，加入稀释剂定容摇匀后，置于（5000±500）Lx光照48h，即得光照破坏样品；

高温破坏称取比卡鲁胺片粉末（相当于比卡鲁胺20mg），置于20mL量瓶内，加入稀释剂定容摇匀后，置于60℃水浴加热8h，即得高温破坏样品；

氧化破坏称取比卡鲁胺片粉末（相当于比卡鲁胺20mg），置于20mL量瓶内，加入30%双氧水2mL，放置6h后，加入稀释剂定容摇匀，即得氧化破坏样品。

表1为破坏后样品的专属性试验结果。

表1 专属性试验结果Tab.1 Results of specific test

从表1可知，在强酸、强碱和光照破坏下，比卡鲁胺主峰面积基本不变，杂峰峰面积之和未明显增加，但在高温与氧化条件下，主峰峰面积下降明显，杂质生成量增多，表明比卡鲁胺在上述条件下不稳定，另外比卡鲁胺的峰面积减小值与各有关物质的峰面积的增多值基本达到平衡，比值均>98%，可知物料基本守恒，通过光电二极管阵列（DAD）检测器测得主峰纯度均大于980，表明主峰未包裹其他杂质，该方法专属性较好。

2.3 线性关系考察

精密称取比卡鲁胺5种杂质的对照品各30.0mg置于100mL量瓶中，加入稀释剂溶解后，定容摇匀，另取上述溶液5mL置于100mL量瓶，加入稀释剂定容摇匀后，分别移取1、2、3、5、10mL置于100mL容量瓶中，加入稀释剂定容摇匀后，按照“1.3项”所述色谱条件注入色谱仪，以峰面积对浓度作标准曲线，并计算线性回归方程，结果见表2。

表2 不同物质的线性关系考察结果Tab.2 Results of linear relationship of different samples

从表2可知，各物质在一定浓度范围内与响应值呈良好的线性关系，相关系数均大于0.99，且方程截距与100%响应值的比值均在20%以内。

2.4 检测限与定量限

将混合对照品溶液逐步稀释后照“1.3项”所述色谱条件进样，以色谱峰信噪比约为3的浓度作为检测限，信噪比约为10的浓度作为定量限，各杂质及比鲁卡胺的检测限与定量限的结果见表3。

表3 不同物质的检测限与定量限（n=6）Tab.3 Results of LOD and LOQ of different samples（n=6）

从表3可知，各已知杂质的定量限浓度均低于ICH要求的报告限浓度（0.1%），因此，可满足定量测定的要求。

2.5 准确度考察

精密称取5种杂质的对照品各20.0mg置于100mL容量瓶中，加入稀释剂溶解后，定容摇匀，另取上述溶液5mL置于100mL容量瓶，加入稀释剂定容摇匀后，分别移取0.5mL和1mL置于100mL量瓶，移取3mL至20mL量瓶后，均加入供试品溶液定容摇匀，配制成各已知杂质浓度分别为50%、100%、120%的加标溶液，按照“1.3项”所述色谱条件，记录色谱图，计算各已知杂质的回收率，结果见表4。

表4 不同杂质测定结果的回收率（n=3）Tab.4 Recovery results of different samples（n=3）

由表4可见，各已知杂质的回收率结果均在96.1%～103.4%范围内，表明该方法对比卡鲁胺杂质的测定结果准确度较好。

2.6 精密度考察

不同实验人员在不同时间下对供试品溶液中有关物质进行测定，记录色谱图峰面积，计算各已知杂质和含量，平行测定6次，结果见表5。

表5 精密度试验结果Tab.5 Results of precision test

从表5可知，不同人员测得的供试品溶液中杂质和的含量平均值分别为0.21%与0.24%，结果RSD低于10%，表明该方法测定比卡鲁胺片有关物质具有良好的精密度。

2.7 稳定性试验

将混合对照品溶液与供试品溶液按照“1.3项”所述色谱条件分别在0、4、8、12、16、20、24h进样，记录色谱图，记录各已知杂质与比卡鲁胺的峰面积，发现混合对照品溶液中比卡鲁胺及杂质A、B、C、D、E的峰面积RSD分别为1.12%、0.88%、0.63%、0.52%、0.85%、1.03%，表明其在24h内稳定性良好，同时供试品溶液中最大单个杂质的峰面积RSD为0.66%，杂质和峰面积的RSD为1.22%，可知在24h内，供试品溶液的测定结果基本无明显改变。