山西某规模化育肥场猪链球菌血清2 型诊断

张 黎，谭 凡，郑龙龙

山西农业大学动物医学学院，太谷 030801

猪链球菌（Streptococcus suis）广泛存在于自然界，是生猪生产过程中极易发生的传染病，严重危害养猪业的发展。病猪常出现脑膜炎、急性败血症等症状，严重影响猪的健康生长，给养殖户造成较大的经济损失。近几年来，猪链球菌病在国内某些地区暴发流行，传播速度快、发病率和死亡率高，大多数呈垂直和水平传播[1]。根据S.suis菌体荚膜抗原特性分为不同的血清型，其中以猪链球菌血清2型（Streptococcus suisserotype 2，SS2）流行最广，对猪的致病性最强[2]。特别是败血型S.suis是山西省SS2 中危害最为严重的菌株[3-4]，青年猪发病突然，病程短、死亡率高，且与非洲猪瘟临床症状相似，对养殖户造成巨大的恐慌和经济危害。

谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase，GDH）基因是SS2 高度保守的毒力基因，能与感染致病性SS2 的猪阳性血清反应；同时，基因特异性高，能够与其他血清型区分，因此GDH 常作为SS2 GDH 诊断抗原用于S.suis血清型的鉴别[5-7]。败血型S.suis发病急，且临床和死亡症状与非洲猪瘟有一定的相似，现场剖检取组织散毒的风险较大。发生败血症时血液中常含有大量的致病菌，是分离致病菌的良好材料。因此，本研究使用抗凝管无菌取尾根血和耳静脉血并混合，进行病原诊断和药敏试验，为该病的临床诊疗提供新思路和用药参考。

1 材料与方法

1.1 样品来源和主要试剂

50 日龄12～15 kg 仔猪（n=10）于早晨巡栏时未见任何异常症状，饲喂0.5～1.0 h 后陆续出现角弓反张、嘶叫、全身颤抖或颈部僵直，偏头或呈一个方向打转划等临床症状。眼结膜充血，流泪有少量脓性分泌物，有浆液性鼻汁，使用镇静剂氯丙嗪和高糖静脉注射及肌肉注射磺胺嘧啶钠、恩诺沙星3 d后，4 头仔猪于发病第3～5 天逐渐开始恢复，但仍有行动障碍，2 头仔猪不能站立；4 头仔猪死亡（发病第1 天死亡2 头，第2 天和第3 天各死亡1 头）。发病猪未用药时使用抗凝管取尾根血和耳静脉血各100～200 μL 并混合，4 ℃保存送检。样品进行细菌分离鉴定、PCR 分型鉴定和药敏试验。EasyTap 聚合酶（北京全式金）；DL1 000 Marker（Biomed），其他化学试剂均从Sigma-Aldrich 公司购买。

1.2 试验方法

1）SS2 分离培养。每100 μL 抗凝血加入200 μL 绵羊血液体培养基，37 ℃ 50 r/min 振荡4 h，取100 μL 增菌液涂布于绵羊血固体培养基37 ℃静置培养24 h，观察菌落周围形成的溶血环。

2）SS2 革兰氏染色。取形成溶血环的SS2 疑似菌落，参考杭州微生物试剂有限公司革兰氏染色液操作说明，进行革兰氏染色。

3）SS2 总DNA 提取和PCR 鉴定。刮取上述鉴定过的SS2 疑似菌落，每个样品取5 个菌落，加50 μL 溶菌酶溶液静置5 min，沸水裂解5 min；4 ℃静置10 min 后作为模板进行PCR 检测，测定SS2GDH基因。根据Kutz 等[8]建立的SS2GDH基因（Genbank：AF229683），设计产物长度为439 bp的特异性引物。GDH-F：5’-CCTTGGTCATGCAC CAAACC-3’，GDH-R：5’-CCTGTTTTTGAAGCAC ACCCAG-3’，生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反应条件为：55 ℃退火20 s，30 个循环，最后再72 ℃延伸5 min。

4）药敏试验。刮取5 个经本文“1.2.2）、1.2.3）”初步鉴定的SS2 分离菌株至1 mL 营养肉汤振荡混匀后，按常规细菌接种方法取菌液100 μL 均匀涂抹在MH 药敏培养基上，并贴上标准药敏纸片（直径6 mm），37 ℃恒温静置培养24 h。

2 结果与分析

2.1 细菌分离

6 份样品在绵羊血固体培养基上均有不同透明程度的β 溶血环，其中4 份陆续死亡的猪全血样品引起的溶血更为明显。疑似菌落呈灰白色、表面光滑、边缘整齐的圆形菌落。

2.2 革兰氏染色

形成溶血环的疑似菌落经革兰氏染色，菌体呈革兰氏阳性，卵圆形菌体7～10 个呈短链状排列；少数菌落的菌体15～20 个排成长链。

2.3 PCR 鉴定

SS2GDH基因检测结果显示，5 例发病猪（用药治疗后死亡的4 头猪、1 头猪不能站立）呈阳性，SS2 阳性率占S.suis分离株的83.3%（5/6）。

2.4 药敏结果

5 例SS2 分离株对恩诺沙星、大观霉素、头孢曲松钠中度敏感（抑菌圈直径分别为14、12、12 mm），对庆大霉素、丁胺卡那霉素、替米考星、链霉素、阿莫西林均耐药（抑菌圈直径均为6 mm）。

3 讨 论

本文采用全血对疑似S.suis感染引起的败血症发病猪进行SS2 分离鉴定，并经PCR 鉴定GDH毒力基因获得5 株SS2，感染率为50%（5/10）。SS2分离株对恩诺沙星、大观霉素、头孢曲松钠中度敏感，建议在饲料中添加恩诺沙星+林可大观霉素进行针对性预防，发病猪肌肉注射头孢曲松钠和氯丙嗪等药物针对性治疗。

S.suis对恶劣环境耐受型较强，污染养殖区后很难彻底清除，极易造成水平传播，并不断向场外扩散。S.suis不仅病猪携带，健康猪携带率也高，而且存在多重耐药和致病性强的菌株[9]。国内研究者报道，采集江西省疑似S.suis感染病死猪的肺脏和关节液进行耐药基因检测，分离株携带四环素类、大环内酯类以及磺胺类、氟喹诺酮类耐药基因[10]。近期国内已报道多起因SS2 引起的猪群发病死亡[11-13]，药物防控效果不理想。从事生猪养殖与屠宰相关行业人员时有SS2感染[14]，该病需要人兽共治，加强从业者的重视。我国已研制出商品化的猪链球菌多价灭活菌、亚单位疫苗，采用疫苗进行免疫接种能明显降低SS2 引起的败血性死亡，对该病的预防和控制有重要意义。