高粱泡叶化学成分的UHPLC-Q Exactive Focus MS/MS分析

李旭东，吴静澜，田孟斌，聂 琴

1.贵州中医药大学药学院(贵州 贵阳 550025)2.国家苗药工程技术研究中心(贵州 贵阳 550025)3.贵州中药炮制与制剂工程技术研究中心(贵州 贵阳 550025)

高粱泡叶是蔷薇科植物高粱泡(RubuslambertianusSer)的干燥叶，药味甘、苦，性平，具有清热凉血、解毒消疮等功效，可应用于治疗感冒发热、咳、便血、崩漏、外伤出血、皮肤糜烂、黄水疮等[1]。通过抑菌试验研究表明其对金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌、绿脓杆菌、大肠杆菌等均有抑制作用[2]。查阅文献，未见对高粱泡叶化学成分研究的相关报道，而高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱法(HPLC-Q-TOF-MS/MS)作为现代常用分析技术，具有操作简便、分析快速、灵敏度高等优点。本研究拟采用HPLC-Q-TOF-MS/MS对高粱泡叶的化学成分开展研究，为探明其药效物质提供实验依据，并为高粱泡叶后续的质量标准构建、药效学研究及新药开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1仪器与试药高粱泡叶样品采自贵州省贵阳市花溪区元芳村，经贵州中医药大学魏升华教授鉴定为蔷薇科植物高粱泡；甲醇(分析纯)国药集团化学试剂有限公司；乙醇(分析纯)国药集团化学试剂有限公司；甲酸(分析纯)天津市科密欧化学试剂有限公司；水为超纯水。

Dionex Ultimate 3000 RSLC(HPG)液相系统(Thermo Fisher Scientific)；Thermo Scientific Q Exactive Focus质谱系统(Thermo Fisher Scientific)；HESI-II离子源(Thermo Fisher Scientific)；752型紫外可见分光光度计(上海恒平科学仪器有限公司)；AUW12D型电子分析天平(日本Shimadzu公司)；超声波清洗器(型号：SK8200H，上海科号超声仪器有限公司)。

1.2方法

1.2.1 供试品溶液制备 精密称取高粱泡叶粉末(过60目筛)1.0 g置于100 mL锥形瓶中，加入80%乙醇30 mL，称重，80 ℃回流提取1 h，补重，过0.22 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

1.2.2 液相色谱分析条件

1.2.2.1 色谱条件 色谱柱：ACE Ultracore2.5 SuperC18(100 mm×2.1 mm,0.5 μm)；流动相为乙腈(0.1%甲酸)-超纯水(0.1%甲酸水)；柱温40 ℃；流速：0.3 mL/min；进样量5 μL；梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

1.2.2.2 质谱条件 电喷雾离子源(ESI)；正/负离子模式；喷雾电压3.0 kV(负离子为-2.5 kV)；毛细管温度320 ℃；鞘气：35 arb；辅助气：10 arb；质谱仪使用前分别对正、负离子分辨率进行校正，使其能在全质荷比范围内满足<2×10-6质谱精度的基本要求。分别设置Fullscan和DD-MS22扫描模式；扫描离子范围100～1 500 m/z；分辨率Fullscan模式为：70 000；DD-MS2模式为：17 500。

1.2.3 化学成分鉴定 根据其相对分子质量和一级、二级质谱碎片离子结合mzVaul本地谱库、mzCloud云谱库及相关文献、色谱峰对应的化合物定性分析，鉴定高粱泡叶的相关化学成分。

2 结果与分析

2.1化学成分鉴定正、负离子模式下，得到的高粱泡叶醇提物的正、负离子见图1，根据其相对分子质量和一级、二级质谱碎片离子结合mzVaul本地谱库、mzCloud云谱库及相关文献、色谱峰对应的化合物定性分析得到化合物61种，主要包括酚酸类、鞣质类、黄酮类、皂苷类、糖类等成分(见表2)。

图1 高粱泡叶样品正、负离子模式下的TIC

表2 高粱泡叶化学成分鉴定信息

2.2化合物裂解规律分析化合物12得到179.033 75[M-H]-质谱信号，碎片离子为135.043 85[M-H-CO2]-、107.049 4[M-H-C2O3]-，结合相关文献报道，推测其为咖啡酸[15]。

正离子模式下，保留时间12.49 min，得到287.0542 3[M+H]+，碎片离子为287.0542 3[M+H]+、153.017 88[M+H-C8H6O2]+，和相关文献报道的一致[10]，推测其为山柰酚。

化合物17在负离子模式下的一级质谱信息得到准分子离子峰m/z 300.998 50[M-H]-，二级质谱碎片离子从高到低有m/z 283.995 64,257.008 456,229.013 335,201.018 48,185.023 30,173.023 38,145.028 09等，对应的离子峰为[M-H-OH]-,[M-H-CO2]-,[M-H-CO2-CO]-,[M-H-CO2-2CO]-,[M-H-2CO2-CO]-,[M-H-CO2-3CO]-,[M-H-CO2-4CO]-，结合相关文献，鉴定该成分为鞣花酸[11]。

在正离子模式下，准分子离子峰为，m/z 268.103 42[M+H]+在二级质谱中，[M+H]+失去1分子呋喃核糖残基形成特征碎片m/z 136.061 61[M+H-C5H8O4]+，根据质谱信息、数据库及文献报道，该碎片与腺苷的理论裂解碎片相似度高，推测该化合物为腺苷[13]。

3 讨论

液质联用技术具有高分辨率、高通量及高灵敏度等特点，常被应用于中药成分分析[14]。近年来已成为中药等复杂成分分析的重要手段。通过比较高粱泡叶化学成分在正、负离子模式下的基峰离子流图，发现正、负离子模式下均有较好的响应，为最大程度地获取药材成分丰富的质谱信息。

本研究利用UHPLC-Q Exactive Focus MS/MS对高粱泡叶醇提物进行全局定性分析，采用Full MS/dd-MS2检测模式结合数据库分析筛查、文献对比等方法，鉴定出高粱泡叶醇提物中61种化合物，由于之前没有对高粱泡叶的化学成分进行过研究，因此本研究所获得的61个化学成分均为首次在高粱泡叶中发现，为后续高粱泡叶醇提物成分及药效研究提供了物质基础。在所得到的高粱泡叶化学成分中，鞣花酸具有较好的抗癌作用，如肺癌、肝癌、结肠癌、前列腺癌及乳腺癌等，还具有抗氧化和抗炎作用[15]。异槲皮素具有抗疲劳、抗炎、抗癌等药理作用[16]，槲皮素具有神经保护，抗阿尔兹海默症、抗肺癌、抗氧化、抗炎等作用[17-20]，这些成分的确定可为深入研究高粱泡药材的药效物质基础及质量控制提供理论依据。

综上所述，本研究通过UPLC-Q-Exactive Focus-MS/MS对高粱泡叶化学成分进行分析，根据其相对分子质量和一级、二级质谱碎片离子结合mzVaul本地谱库、mzCloud云谱库及相关文献定性分析得到化合物61种，主要包括酚酸类、鞣质类、黄酮类、皂苷类、糖类等成分。