融合多种技术的隐色孔雀石绿印迹传感器的制备及其应用

秦丽，李东东，田景升，韩俊华，张寅，李建文，高文惠

（1 河北科技大学食品与生物学院，河北 石家庄 050000；2 石家庄市食品药品检验中心，河北 石家庄 050011）

孔雀石绿（malachite green，MG）属于人工合成的三苯甲烷类有机化合物，针对鱼体水霉病和鱼卵的水霉病有特效[1]。然而MG 及其代谢物的高残留现象和“三致”等毒副作用也已被公开报道[2-3]。我国农业部第235号公告明确规定孔雀石绿禁用于所有食品动物中，所有可食组织中不得检出。但因为市场上暂时缺少针对水霉病治疗的特效药，许多不法商家为了保证利益不惜铤而走险，使得MG的违规使用屡禁不止。MG经鱼体等迅速代谢后，以毒性更强的隐色孔雀石绿（leuco malachite green，LMG）贮藏在肌肉组织中，食用后可对人类的生命健康造成严重伤害[4]。因此，为了加大食品安全监测力度，保障消费者饮食安全，研发高效快速、灵敏且抗干扰能力强的检测LMG 的方法是一项迫切任务。

国内外用于MG及LMG的检测方法主要有高效液相色谱法[5-7]、液相色谱-串联质谱法[8-10]和免疫法等[11-13]。其中色谱法存在仪器昂贵、前处理复杂耗时长、难以实现快速检测等不足；免疫法存在不耐酸碱、易失活、结果可能出现假阳性等缺点。鉴于水产品样品中基质复杂，含有较多的干扰物质，需要选择性更强、稳定性更好的快速检测方法，而性能优越的分子印迹电化学传感器（molecularly imprinted electrochemical sensor，MIECS）可满足要求。

近年来，分子印迹技术与电化学分析技术相结合，弥补了色谱技术的不足，不仅样品前处理得到简化，检测时间短，操作简单，而且可以特异识别目标物质，灵敏度高，它的应用降低了食品复杂基质对检测结果的影响[14]；自组装技术（selfassembled technology，SAT）的引入为增加分子印迹膜（molecularly imprinted membrane，MIM）上有效识别位点带来了新的思路，模板分子与功能单体间的自组装赋予了印迹膜一定的有序性，增加了有效印迹位点的数量[15]；紫外光谱法与计算机模拟技术的应用极大地简化了筛选功能单体的工作，其中，通过计算机模拟技术优化分子构型及其预组装体系，使得模板分子与功能单体之间的作用形式与作用机理能更清晰、更直观地呈现[16]；结合紫外光谱法测定其吸光度及最大吸收波长，进一步确定功能单体以及模板分子与功能单体之间的作用形式及比例[17]。因此，SAT、计算机模拟技术和紫外光谱法的引入可为分子印迹聚合物（molecularly imprinted polymer，MIP）的制备和应用提供理论指导，将MIP对目标物质特异性识别的特点与电化学分析快速检测的优势相结合可研制出LMGMIECS，以实现对水产品中LMG 的高效快速检测，有效监控水产品的质量安全。

目前，融合上述多种技术检测水产品中LMG的方法尚未见报道。本实验以LMG 为模板分子，拟以带巯基及活性基团的苯环结构化合物为功能单体，采用计算机模拟技术、电化学和紫外光谱技术对模板分子和功能单体的预组装体系进行分析并优化制备条件。采用还原氧化石墨烯（reduced graphene oxide，RGO） 和 纳 米 金 粒 子（Au-nanoparticles，AuNPs）层层修饰玻碳电极，使用SAT 使模板分子与功能单体形成有序自组装膜，通过电聚合法制备LMG 分子印迹电化学传感器。通过循环伏安法（cyclic voltammetry，CV）和方波伏安法（square wave voltammetry，SWV）考察该传感器的电化学性能，并将其应用于实际样品的快速检测中。

1 实验材料和方法

1.1 材料与试剂

CHI660E 型电化学工作站，三电极系统[玻碳电极（glassy carbon electrode，GCE），Ag/AgCl 参比电极，铂丝电极]，上海辰华仪器有限公司；S-4800-1 扫描电镜，日本HITACHI；ALPHAⅡ红外光谱仪，德国布鲁克公司。

LMG （98%），MG （98%） 4-氨基苯硫酚（4-aminothiophenol， 4-ATP， 99%）， 结 晶 紫（98%），氯霉素（98%），喹乙醇（98%），4-羟基苯硫酚（4-mercaptophenol，4-MAP），硫代双苯硫酚（4, 4'-thiobisbenzenethiol， TBBT）， 壳 聚 糖（chitosan，CS，脱乙酰度≥95%），RGO（98%），阿拉丁试剂有限公司；氯金酸（含金量47.3%），南京试剂厂；其余试剂均为分析纯；实验用水为超纯水。实验样品：草鱼、小龙虾、海带（均购于市场）。

1.2 计算机模拟分析

1.2.1 计算平台

计算软件：Gaussian 09，Gauss View 6.0。

计算硬件：PC计算机，12GB运行内存，2T硬盘，Windows操作系统。

1.2.2 计算方法

（1）应用Gauss View 软件建立模板分子LMG与功能单体4-ATP的几何构型。

（2）利用Gaussian 09 软件，采用密度泛函理论（density functional theory，DFT）M06-2X[18-19]方法，在6-311+G(d,p)基组条件下，优化LMG 与4-ATP的分子构型，并进行频率分析，获取热力学数据；对各种分子进行红外光谱分析，以证实分子构型无虚频且稳定。

（3）采用M06-2X/6-311+G(d,p)算法并加入色散校正项对LMG 与4-ATP 不同比例的复合物模型进行优化并计算其振动频率，获取热力学数据。通过计算所有复合物的结合能大小，分析作用机理。计算结合能时， 基组迭加误差（basis set superposition error，BSSE）采用目前使用最广泛的Boys和Bernardi提出的counterpoise方法[20]消除。

结合能ΔE的计算如式(1)所示，校正后能量CΔE计算如式(2)。

式中，Ecomplex为复合物能量；Etemplate为模板分子能量；ΣEmonomer为功能单体总能量；EBSSE为BSSE 校正能。

1.3 AuNPs/RGO/GCE制备

取0.02g RGO 加入10mL DMF，经搅拌、超声分散后得2g/L RGO-DMF分散液，并将其与相同体积的CS-1% CH3COOH 溶液混合，得到RGO 修饰剂。将其滴涂于GCE表面，烘干后得修饰电极RGO/GCE。将RGO/GCE置于含有0.6g/L HAuCl4·4H2O的0.1mol/L H2SO4沉积液中，采用计时电流法在-0.2V下沉积600s，使RGO/GCE 表面通过电沉积的方式将AuNPs 修饰在RGO/GCE 表面制成金基底，得到沉积电极AuNPs/RGO/GCE。

1.4 MIP/AuNPs/RGO/GCE制备

1.4.1 功能单体的自组装

将AuNPs/RGO/GCE 浸于10mmol/L 4-ATP 乙腈溶液中，室温下自组装20h，使功能单体4-ATP与金基底之间充分形成金硫键，让4-ATP 尽可能多地占据金基底表面；然后将电极移至5mmol/L LMG乙腈溶液中浸泡5h，使得电极表面的4-ATP 与LMG之间充分产生π-π作用。

1.4.2分子印迹电极的制备

将已自组装的电极置于聚合液中，采用CV 在0～2.2V 电位范围内进行电聚合，得到一层致密且绝缘的聚合物膜，将已聚合完成的电极浸入乙醇-0.4mol/L NaOH 水溶液（3∶1，体积比）中洗脱50min，用水反复冲洗，得到MIP/AuNPs/RGO/GCE。

1.5 样品处理

称取捣碎后样品（草鱼、小龙虾、海带）2.00g 置于50mL 离心管中，加入10mL 乙腈溶液，振荡、超声、离心（6000r/min、10min）；取上清液，再次加入5mL 乙腈二次提取；合并两次上清液，用乙腈定容至20mL，待测。

1.6 电化学测量方法

电化学测量的设定参数如下：CV，扫描电位为-0.2～0.8V，扫描速率为50mV/s；SWV，起止电位为-0.1～0.6V，电位增量0.005V，脉冲幅度0.025V，频率5Hz。

2 结果与讨论

2.1 AuNPs/RGO/GCE的形貌表征

采用扫描电镜对AuNPs/RGO/GCE 的形貌进行表征[图1(a)]，由图1(a)可见大量粒径为60～80nm的AuNPs 颗粒较均匀分布在RGO 表面，这种结构能显著增大电极的比表面积。此外，通过X射线能量色散谱分析方法[图1(b)]进一步证明了Au元素在GCE 上的存在，由此表明已成功制备AuNPs/RGO/GCE。

图1 AuNPs/RGO/GCE的扫描电镜图(a)和能谱图(b)

2.2 红外光谱表征

利用红外光谱对LMG、洗脱LMG 前MIP、非印迹聚合物（non-imprintedpolymer，NIP）及洗脱LMG后的MIP的化学结构进行表征（图2）。图2(b)中，1515cm-1、1610cm-1为模板分子LMG 中芳环双键伸缩振动吸收峰，1349cm-1为LMG 中芳叔胺的伸缩振动，2883cm-1为LMG 中—CH3的伸缩振动；图2(b)为LMG 洗脱前的MIP，图2(a)、(b)的对比证明了洗脱LMG 前MIP 中LMG 的存在；图2(c)、(d)中，可看出LMG的芳环、氨基、—CH3的吸收峰明显减弱，洗脱LMG后的MIP与NIP的吸收特征峰曲线几乎一致，说明在自组装和电聚合过程中结合在MIP的LMG被大部分洗脱下来，在MIP中留下了与LMG 形状、大小完全匹配的空穴，可实现对模板分子LMG的特异性吸附。

图2 红外光谱图

2.3 LMG-MIECS电化学性能

采用CV表征修饰电极的修饰效果及LMG印迹传感器的印迹效果。由图3(a)中曲线g 可以看出探针离子在裸电极表面上发生了氧化还原反应，形成了对称且可逆的氧化还原峰；当电极经RGO 修饰后[图3(a)曲线f]，其峰电流值明显高于裸电极，这是由于RGO 有效地提高了电子的转移速率；在RGO 表面沉积一层纳米金后峰电流进一步增加，同时在0.2V附近出现了金的特征还原峰，如图3(a)中曲线e所示，说明AuNPs的修饰明显提高了电极的灵敏度。当修饰电极完成自组装后，氧化峰电流明显下降[图3(a)曲线c]。修饰电极经电聚合后[图3(a)曲线b]响应电流值几乎为0，表明此时电极表面形成了致密且几乎不导电的MIM。经洗脱模板分子后的印迹电极[图3(a)曲线a]由于洗脱剂破坏了功能单体与模板分子之间的作用力，使模板分子脱附下来，形成与模板分子空间结构相吻合的三维印迹空穴，探针离子通过印迹空穴在电极表面实现电子转移。此外，实验进一步采取SWV 对结果进行了验证，通过比较图3(a)、(b)可以看出两种表征方法效果一致。结果表明LMG 印迹传感器已被成功制备并具有良好的修饰效果和印迹效果。

图3 MIECS修饰效果和印迹效果表征

2.4 功能单体的选择及计算机模拟预组装体系分析

2.4.1 功能单体的设计

依据自组装技术，通过对工作电极外层修饰材料性质以及LMG 的结构及其所含官能团[图4(a)]进行分析，选取最佳功能单体，设计LMG-MIECS。与功能单体相连的外层修饰材料是经AuNPs 修饰后的金粒子基底，因此功能单体的首端基团可使用巯基等可与金基底形成稳定Au—S键的官能团。功能单体与修饰层间形成稳固的共价键，能提高印迹位点与MIM 的稳定性。LMG 分子结构中带有三个苯环，其环结构与π键特性较为明显，因此考虑选用带有苯环的功能单体，可与LMG 通过苯环之间的π-π 作用相结合，并且苯环的堆叠增大了分子间的摩擦力，有利于增加功能单体间的紧密程度，减少MIM 结构松散等问题。经考察，4-ATP、4-MAP、TBBT 基本满足设计要求，其结构式如图4(b)～(d)所示。

图4 模板分子与功能单体结构式

2.4.2 紫外光谱法筛选功能单体

选择合适的功能单体在MIECS 的制备过程中起着非常重要的作用，然而大多数模板分子结构较为复杂，酸性、碱性等多种性质差异较大的基团往往共存于同一分子结构中，同时由于空间位阻对分子间稳定结合的阻碍，导致难以单纯依靠经验筛选出最佳功能单体以及对模板分子与功能单体的配比进行判断。电化学法作为传统筛选功能单体的方法，工作量较大且耗时较长。然而，紫外光谱法可以克服上述缺点，能简单准确地筛选功能单体及其与模板分子的配比[21-22]。在紫外光谱理论中，当两种物质不发生作用时，该两种物质混合物的吸光度在任意波长下应为两者吸光度数值的加和，此数值被称为吸光度的理论值[23]。然而分子之间受共轭效应、氢键等相互作用的影响，会使混合物吸光度的大小偏离理论值，即实际测量值与理论值之间会产生一定差异。当吸光度的理论值与实际值之间差值越大，表明两者之间的相互作用力越强[17]。

实验初步对4-ATP、TBBT、4-MAP 三种常见功能单体进行筛选，如图5所示。在最大吸收波长下，三种功能单体和LMG 作用的实际吸光值与理论吸光值之差分别为0.6580、0.4258 及0.4781，由此可知LMG 与4-ATP 之间的相互作用力最大。因此确定最佳功能单体为4-ATP。

图5 模板分子与功能单体紫外光谱曲线

2.4.3 分子构型优化及红外光谱分析

根据ChemFinder 检索得到模板分子与所选功能单体的结构式，用Gauss View 6.0 软件分别构造各分子初始模型，使用Gaussian 09 软件在M06-2X/6-311+G(d,p)水平下优化分子构型，并对振动频率进行计算，优化后的各分子构型如图6所示。

图6 分子构型优化

通过对优化后的分子进行红外光谱分析，如图7所示，可明显看出模板分子与功能单体的振动频率。LMG 与4-ATP 的最低频率分别为23.93cm-1和117.19cm-1，在所有模式下的振动频率均为正值，未出现虚频现象，说明在该计算方法下所有构型均得到收敛。

图7 LMG和4-ATP的红外光谱图

2.4.4 计算机模拟分析预组装体系结合能

通过构建LMG 与4-ATP 比例为1∶1、1∶2 及1∶3 的复合物模型，优化不同比例下复合物的构型，优化后的各比例下最优构型如图8所示。对比不同比例复合物优化后的结果，可见LMG-2(4-ATP)型复合物在空间构型上较为规则、紧密，如图8(b)所示。2 个4-ATP 分子通过苯环间的共轭效应紧密结合在LMG 分子上，空间上的紧密性确保了所形成的印迹“空穴”在大小和形状上与LMG互补，更好地显示其特异性；并且2个4-ATP分子上的巯基均在LMG 分子的同一侧，在空间上更方便与AuNPs 成键，使得自组装的有序性更为明显，与紫外光谱法筛选功能单体的结果一致。当继续增加功能单体数量时，如图8(c)所示，所增加的4-ATP在空间上未与LMG上的苯环产生共轭作用。

图8 不同比例模板分子与功能单体的复合构型优化

LMG与4-ATP不同比例复合物的结合能如表1所示。结果表明，复合物中4-ATP 数量增加时，所释放的热量随之增加。形成LMG-2(4-ATP)型复合物所释放的热量与形成LMG-(4-ATP)型复合物所释放的热量相比增加了57.459kJ/mol，形成LMG-3(4-ATP)型复合物时释放出的热量比上一级仅增长了16.223kJ/mol，远小于之前的增幅，说明LMG 与4-ATP 形成LMG-2(4-ATP)型复合物时，LMG 上所结合4-ATP 的能力达到饱和，因此主要形成了LMG-2(4-ATP)型复合物且该复合物空间构型稳定。

表1 不同比例模板分子与功能单体复合物的能量和结合能

2.5 实验条件的优化

2.5.1 自组装时间的优化

实验对功能单体与金基底通过自组装形成金硫键至饱和的时间进行了探究，实验从16h起每隔2h对自组装电极进行一次CV 表征，如图9 所示。随着自组装时间增加，金的特征还原峰逐渐减弱，当自组装时间达20h 时，金的特征还原峰基本消失，说明此时功能单体与金基底之间的结合已达饱和状态，因此选取最佳自组装时间为20h。

图9 自组装时间的优化

2.5.2 聚合体系中模板分子与功能单体物质的量浓度比的确定

在MIM 聚合过程中，功能单体的用量会影响MIECS的灵敏性和稳定性。一方面，如果功能单体数量过少，会延长MIM 的形成时间，阻碍模板分子与功能单体之间的结合，从而会降低印迹位点的数量和MIECS 的灵敏性。另一方面，过多的功能单体会导致功能单体自身产生缔合现象，使特异性识别位点减少，降低选择性[24]。

实验采用紫外光谱法对聚合体系中模板分子与功能单体的配比进行了优化，如图10(a)所示。以不同物质的量比混合体系的紫外光谱最大吸收为纵坐标，最大吸收波长为横坐标作图，如图10(b)所示。可知在(1∶1)～(1∶4)的比例范围内混合体系的紫外吸光度呈上升趋势，且最大吸收波长发生了明显蓝移，说明在(1∶1)～(1∶4)的物质的量比内，随着4-ATP 比例的增大，LMG 与4-ATP 之间形成的共轭效应逐渐增强，进一步验证了计算机模拟对LMG 与4-ATP 之间预组装体系结合能的理论计算结果。当混合体系物质的量比在(1∶4)～(1∶8)的范围内又产生了红移现象，说明继续增大功能单体的比例会使功能单体之间发生自聚，使得功能单体之间出现缔合现象，会减少印迹位点的生成，降低灵敏度。因此确定聚合体系中LMG 与4-ATP 的最佳物质的量比为1∶4。

图10 紫外光谱法优化聚合体系配比

2.5.3 聚合圈数的优化

实验采用CV 进行电聚合，该方法形成的MIM表面致密均匀且可通过改变聚合圈数对MIM 的厚度进行控制。由图11可知，随着聚合圈数的增加，电极的响应峰电流值不断减小；当扫描20 圈时，响应值趋近于0；而聚合超过20 圈的MIM 在洗脱模板分子后仍存在不同程度的模板分子被包埋的现象，使形成的印迹空穴相对较少，导致洗脱后的MIM 在表征溶液中的响应峰电流下降。因此，实验确定最佳聚合圈数为20圈。

图11 聚合圈数的优化曲线

2.5.4 洗脱条件的优化

对MIM 进行模板分子洗脱时发现，通过在乙醇、甲醇等极性溶液中浸泡的方式洗脱，效果不理想。因此，通过在洗脱剂中加入酸、碱的方式增大洗脱剂极性从而加大洗脱剂对模板分子与功能单体间作用力的破坏程度。但使用酸性洗脱剂洗脱时发现MIM有破裂现象，是因为RGO修饰层中的CS溶于弱酸，使得RGO 修饰层被破坏。因此选择在甲醇、乙醇、乙腈中添加NaOH 制成碱性洗脱剂对MIM进行洗脱，结果表明，乙醇-0.4mol/L的NaOH水溶液（3∶1，体积比）作为洗脱剂时，具有良好的洗脱效果，而其他条件下洗脱效果均不佳。

实验进一步优化了洗脱时间，将印迹电极置于洗脱剂中进行搅拌洗脱，每5min 取出电极，用水冲洗，氮气吹干，采用SWV 进行表征，结果如图12所示。当洗脱50min时峰电流达到最大，之后逐渐趋于平稳，说明50min 时MIM 上的LMG 最大程度上被去除。综上确定洗脱时间为50min。

图12 模板分子洗脱时间优化曲线

2.6 选择性

选取与模板分子LMG结构类似的MG和结晶紫作为结构类似物，干扰物质选用可能用于治疗水产品疾病的药物氯霉素和喹乙醇，将印迹传感器分别在1µmol/L的五种药品的标准溶液中吸附相同的时间，通过SWV 考察吸附前后的响应峰电流变化（ΔI）以研究传感器的选择性，结果如图13 所示。由图13 可见，该传感器对LMG 吸附能力最强，对MG 的吸附能力稍低，对结晶紫的吸附能力较小，而对干扰物质几乎无响应。结果表明该MIECS 具有良好的选择性。

图13 印迹电极的选择性

2.7 线性关系与检出限

配制浓度为1.0×10-4～1.0×10-11mol/L 的LMG 标准溶液，将印迹电极浸泡到空白溶液及上述不同浓度的LMG 标准溶液中吸附相同时间，分别测定吸附后电极的SWV 响应曲线，以不同浓度LMG 标准溶液对应的-lgC为横坐标，ΔI为纵坐标作图。通过图14 可以看出，LMG 在3.3×10-11～1.0×10-6mol/L浓度范围内与ΔI呈良好线性关系，线性方程为ΔI=0.8004lgC+15.1457，线性相关系数R2=0.9914，以S/N=3确定LMG的检出限为1.0×10-11mol/L。

图14 线性关系曲线

2.8 回收率与精密度

在最佳实验条件下，按1.5 节方法处理的水产样品（草鱼、小龙虾、海带）在1.0×10-9mol/L、1.0×10-8mol/L 和1.0×10-7mol/L 加标水平下进行回收率实验，结果如表2所示。样品加标平均回收率为85.5%～101.2%，RSD为1.28%～2.48%（n=5）。结果表明该MIECS的测定结果准确可靠。

表2 水产样品的加标回收率和精密度（n=5）

2.9 重现性与稳定性

平行制备3支印迹电极，进行连续吸附（同一浓度的LMG标准溶液）-洗脱-检测20次，并在表征溶液中分别对其进行电化学检测，相对标准偏差小于等于1.82%（n=20），表明此MIECS 重现性良好。实验将制备的印迹电极在4℃下保存，分别在放置7d、14d、21d 后，在探针离子溶液中对其进行电化学检测，其实际测量值分别为初始值的92.6%、89.9%及83.2%。结果表明，制得的LMG印迹电化学传感器稳定性良好，可在一定条件下稳定保存并重复使用。

2.10 实际样品检测

将印迹传感器应用于小样本量的实际样品（草鱼、小龙虾、海带）的检测中，按1.5节方法处理样品，取10mL 样液，通过1.6 节方法检测，结果未在样品中检出LMG。

2.11 与其他方法比较

与文献报道的其他方法比较，如表3所示。本实验方法检出限低，线性范围宽，满足样品中LMG检测要求。

表3 本文方法与其他测定LMG的方法比较

3 结论

以RGO 和AuNPs 作为玻碳电极的纳米修饰材料，其比表面积大、导电性能高、稳定性好，可提高电极的灵敏度；以LMG 为模板分子，将紫外光谱法与计算机模拟计算相结合筛选4-ATP 为功能单体；通过自组装20h 与电聚合20 圈制备LMGMIECS。应用计算机模拟技术对模板分子与功能单体之间的作用形式和机理进行研究，两者通过共轭效应产生相互作用，形成了构型稳定的LMG-2(4-ATP)型复合物；结合紫外光谱法进一步验证，在1∶1～1∶4 的物质的量比范围内，LMG 与4-ATP之间的共轭效应随着4-ATP比例的增大逐渐增强，形成与LMG在大小和形状上互补的印迹“空穴”。

通过CV、SWV 对制备条件进行优化，并对该MIECS 的印迹效果、选择性及分析性能进行了考察。结果表明，所制备的MIECS 具有优异的印迹效果以及良好的选择性、重现性与稳定性；该方法在3.3×10-11～1.0×10-6mol/L 之间线性关系良好，检出限为1.0×10-11mol/L，样品平均回收率为85.5%～101.2%，RSD 为1.28%～2.48%。因此，本实验将计算机模拟技术、紫外光谱技术、自组装技术及电化学分析等多种技术相融合制备的LMG-MIECS 可用于水产品中LMG 的灵敏快速检测，满足食品安全快检需求。本研究有望为简化、精准地筛选功能单体以及开发性能更优越的分子印迹电化学传感器的研究提供新的思路和方法。