基于IL-4/STAT6通路研究吴茱萸次碱对特应性皮炎模型小鼠的改善作用*

顿耿，祁相焕，吴德福，臧馥兰，王哲新

开封市人民医院，河南 开封 475000

特应性皮炎又称遗传过敏性皮炎，是一种慢性非特异性皮肤炎症，好发于儿童，主要表现为瘙痒、皮肤干燥和湿疹，严重影响患者的生活质量[1]。吴茱萸次碱是一种吲哚喹唑啉类生物碱，提取自传统中药吴茱萸。研究发现，吴茱萸次碱具有广泛的药理学活性，可通过调节免疫失衡、降低氧化应激反应保护局灶性脑缺血脑组织损伤[2]，口服吴茱萸次碱可激活抗氧化酶保护乙酰氨基酚诱导的小鼠急性肝损伤，改善肝功能[3]，吴茱萸碱衍生物还可通过抑制核苷酸结合寡聚化结构域样受体3(nucleotides bind to oligomeric domain-like receptor 3，NLRP3)炎症体相关炎症因子调节胆固醇转运，从而减轻动脉粥样硬化[4]。辅助性T淋巴细胞1(T-helper 1，Th1)/Th2细胞亚群功能失衡是特应性皮炎发病的主要原因之一，白细胞介素-4(interleukin-4，IL-4)是诱导Th2细胞分化的关键调节因子，也是Th2细胞的特征性细胞因子，而信号转导及转录激活因子6(signal transducer and activator of transcription 6，STAT6)是Th2细胞的特异性转录因子[5]，研究发现，白头翁皂苷B4可通过抑制IL-4/STAT6信号通路降低炎症反应，改善慢性阻塞性肺疾病损伤[6]。既往研究显示，吴茱萸次碱可改善炎症性皮肤病(银屑病)的症状，调节免疫细胞，减轻炎症反应[7]。本研究通过建立特应性皮炎小鼠模型，探讨吴茱萸次碱对炎症性皮肤病的治疗作用机制。

1 材料

1.1 动物50只4周龄SPF级雄性C57BL/6小鼠，体质量20～25 g，购自北京北科华夏生物医药科技有限公司，使用许可证号：SYXK(京)2017-0044，饲养环境：室温20～25 ℃，相对湿度50%～70%，自由饮食饮水，昼夜交替12 h。该实验经开封市人民医院动物伦理委员会批准，伦理审批号：KFSRMYY2019050026。

1.2 药物与试剂吴茱萸次碱(武汉科斯坦生物科技有限公司，纯度≥98%，批号：84-26-4)；泼尼松龙(北京康瑞纳生物科技有限公司，批号：B6374)。HE试剂盒、丙酮、橄榄油(上海碧云天生物科技有限公司，批号：C0105、ST1663、KNK437)；2，4-二硝基氟苯(2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB，美国Sigma公司，批号：265179)；细胞因子干扰素γ(interferon gamma，IFN-γ)、IL-4、IL-5、免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)试剂盒(美国Invitrogen公司，批号：KHC4021、A42893、BMS610、EMIGHE)；兔抗鼠STAT6抗体、嗜酸粒细胞趋化因子(eotaxin)抗体、细胞因子信号抑制因子1(suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1)抗体、GAPDH抗体(美国Abcam公司，货号：ab32108、ab133604、ab280884、ab8245)。

1.3 仪器1658033型电泳仪(美国BIO-RAD公司)；A51119500C型酶标仪、ST16R型低温高速离心机(美国Thermo Fisher Scientific公司)；XPR226CDR/AC型电子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；EG1150型包埋机、RM2255型切片机、DM2700P型显微镜(德国徕卡公司)；VE-186型转移电泳槽、Tannon-2500型凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)。

2 方法

2.1 动物分组、模型制备和给药50只小鼠随机分为正常组、模型组、阳性对照组、吴茱萸次碱低剂量组和吴茱萸次碱高剂量组，每组10只，除正常组外，其余组小鼠建立特应性皮炎模型[8]，具体操作如下：在小鼠耳部无损伤皮肤3 mm×3 mm范围内剃毛，丙酮和橄榄油以体积比31配制，添加DNFB制成浓度为1%的混悬液，第1天和第8天在每只小鼠耳部裸露皮肤上涂抹100 μL 1% DNFB混悬液，第15天和第16天相同部位剃毛，涂抹50 μL 1% DNFB混悬液，以出现抓痕、红斑出血、结痂等表现视为造模成功，正常组小鼠相同部位剃去毛发，并于相同时间点涂抹丙酮和橄榄油混悬液。造模成功4 h后，阳性对照组小鼠灌胃给予10 mg·kg-1泼尼松龙溶液，吴茱萸次碱低、高剂量组小鼠灌胃给予10 mg·kg-1、20 mg·kg-1吴茱萸次碱溶液，正常组和模型组小鼠灌胃等量生理盐水，每天1次，连续14 d。

2.2 耳部炎症评分测定末次给药结束后，评估耳部皮损处炎症严重程度，并进行评分，0分为无皮损；1分为无皮损但可察觉红斑和丘疹或浸润；2分为轻度红斑和丘疹或浸润；3分为中度红斑和丘疹或浸润；4分为重度红斑和丘疹或浸润；5分为非常严重的红斑和丘疹或浸润，同时伴有渗出和结痂。手术剪获取各组小鼠右耳，并用游标卡尺测量皮损部位厚度。

2.3 ELISA检测小鼠血清中IFN-γ、IL-4、IL-5和IgE含量小鼠麻醉后，打开胸腔，收集主动脉血，室温静置30 min，3 000 r·min-1离心10 min(离心半径8 cm)，收集上清为待测样品，根据ELISA试剂盒说明书，梯度稀释标准品，设置空白孔、对照孔和待测样品孔。加入待测样品后，轻轻摇晃混匀，置于37 ℃水浴锅中避光孵育30 min，加入抗体稀释液后，37 ℃水浴锅中避光孵育30 min，加入亲和素过氧化物酶复合物后，37 ℃避光孵育30 min，洗涤液清洗5次，甩干，加入显色液，显色30 min，加入终止液终止反应，置于酶标仪上，测定波长450 nm处的吸光度(absorbance，A)值，根据标准品，建立标准曲线，测定待测样品浓度。

2.4 耳部组织HE染色剪取部分耳组织，常规脱水、包埋、制成厚度为4 μm的石蜡切片，滴加苏木素染液于组织切片上染色5 min，酸性乙醇分化，双蒸水冲洗，滴加伊红染液于组织切片上染色3 min，双蒸水清洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，晾干后置于显微镜下观察并拍照。

2.5 Western Blot检测耳组织中相关蛋白表达水平取部分耳组织，液氮中研磨，加入裂解液裂解 30 min，12 000 r·min-1离心10 min(离心半径 10 cm)，收集上层蛋白样品，BCA试剂盒测定蛋白浓度，裂解液调整蛋白浓度，100 ℃煮沸10 min使蛋白变性稳定。设置电泳仪恒压80 V电泳30 min后120 V电泳1.5 h，电泳结束后，设定电泳仪参数恒流0.3 A湿转2 h，TBST洗膜3次，胎牛血清室温封闭1 h，加入STAT6、SOCS1、eotaxin和GAPDH一抗(稀释比例为11 000)4 ℃孵育过夜，加入二抗(稀释比例为15 000)室温孵育2 h，TBST洗膜3次，ECL法显色，Image J分析蛋白条带灰度值，目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/GAPDH条带灰度值。

3 结果

3.1 吴茱萸次碱对特应性皮炎小鼠皮炎评分及右耳厚度的影响与正常组比较，模型组小鼠耳部出现充血水肿、糜烂、干燥脱屑、结痂等炎性症状，皮炎评分及右耳厚度显著升高(P<0.05)；与模型组比较，各给药组小鼠耳部炎性症状减轻，皮炎评分及右耳厚度明显降低(P<0.05)；与阳性对照组比较，吴茱萸次碱低、高剂量组小鼠皮炎评分及右耳厚度显著升高(P<0.05)；与吴茱萸次碱低剂量组比较，吴茱萸次碱高剂量组小鼠皮炎评分及右耳厚度显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 吴茱萸次碱对特应性皮炎小鼠皮炎评分及右耳厚度的影响

3.2 吴茱萸次碱对特应性皮炎小鼠血清中IFN-γ、IL-4、IL-5和IgE含量的影响与正常组比较，模型组IL-4、IL-5和IgE含量显著升高(P<0.05)，IFN-γ含量显著降低(P<0.05)；与模型组比较，各给药组IL-4、IL-5和IgE含量显著降低(P<0.05)，IFN-γ含量显著升高(P<0.05)；与阳性对照组比较，吴茱萸次碱低、高剂量组IL-4、IL-5和IgE含量显著升高(P<0.05)，IFN-γ含量显著降低(P<0.05)；与吴茱萸次碱低剂量组比较，吴茱萸次碱高剂量组IL-4、IL-5和IgE含量显著降低(P<0.05)，IFN-γ含量显著升高(P<0.05)。见表2。

表2 吴茱萸次碱对特应性皮炎小鼠血清中IFN-γ、IL-4、IL-5和IgE含量的影响

3.3 吴茱萸次碱对特应性皮炎小鼠耳部组织结构的影响正常组小鼠耳部组织皮肤结构正常完整，无水肿和炎性细胞浸润；模型组小鼠皮肤结构缺失，明显水肿，可见大量炎性细胞浸润；与模型组比较，各给药组小鼠耳部组织病理损伤得到显著改善，其中阳性对照组和吴茱萸次碱高剂量组小鼠皮肤结构较完整，细胞轻度水肿，少量炎性细胞浸润。见图1。

注：A：正常组；B：模型组；C：阳性对照组；D：吴茱萸次碱低剂量组；E：吴茱萸次碱高剂量组图1 小鼠耳部组织HE染色(×200)

3.4 吴茱萸次碱对特应性皮炎小鼠耳部组织中 IL-4/STAT6信号通路相关蛋白表达水平的影响与正常组比较，模型组IL-4、STAT6和eotaxin蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，SOCS1蛋白表达水平显著降低(P<0.05)；与模型组比较，各给药组 IL-4、STAT6和eotaxin蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，SOCS1蛋白表达水平显著升高(P<0.05)；与阳性对照组比较，吴茱萸次碱低、高剂量组IL-4、STAT6和eotaxin蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，SOCS1蛋白表达水平显著降低(P<0.05)；与吴茱萸次碱低剂量组比较，吴茱萸次碱高剂量组IL-4、STAT6和eotaxin蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，SOCS1蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。见表3，图2。

表3 吴茱萸次碱对特应性皮炎小鼠耳部组织中IL-4/STAT6信号通路相关蛋白表达水平的影响

注：A：正常组；B：模型组；C：阳性对照组；D：吴茱萸次碱低剂量组；E：吴茱萸次碱高剂量组图2 Western Blot检测特应性皮炎小鼠耳部组织IL-4/STAT6信号通路相关蛋白表达水平

4 讨论

特应性皮炎是一种由皮肤功能障碍及免疫反应引起的慢性皮肤病，其致病因素与遗传、感染、免疫失衡等有关，受干扰部分的皮肤组织对外部抗原或过敏原渗透性增强，导致角质层细胞先天免疫因子释放增加及Th2型T细胞浸润增加，Th2细胞分泌多种炎性因子，包括IL-4、IL-5和IL-13，多种炎性细胞的浸润导致特应性皮炎的发生[9]。目前，对于特应性皮炎的治疗常采用局部使用类固醇或抗菌药物，但常规治疗手段存在不良反应，因此寻找有效的治疗药物和靶点是临床研究的热点。

中医认为特应性皮炎属于“乳癣”“奶癣”“胎敛疮”等病证范畴，中医学者对其具体病因有丰富的论述，多数学者认为该病因为先天禀赋不足、脾失健运、生湿化热，复感风湿邪热，蕴结肌肤，内外合邪而致，根据病因不同可分为胎热型、脾虚型和血造型。吴茱萸属芸香科植物，所含化学成分包括生物碱、苦味素和挥发油等，始载于《神农本草经》，其主要成分吴茱萸次碱具有多种药理学活性，可保护阿霉素造成的H9C2心肌细胞损伤，增强细胞活力，抑制细胞凋亡[10]，还可通过调节免疫平衡，在前列腺癌小鼠中发挥抗癌作用[11]，改善高蔗糖诱导的阿尔茨海默病小鼠认知功能障碍[12]，抑制Toll样受体4(toll like receptor 4，TLR4)/核转录因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)炎性信号通路保护大鼠心肌缺血再灌注损伤[13]。此外，吴茱萸次碱在炎症性疾病中具有显著疗效，可降低葡聚糖硫酸钠诱导的溃疡性结肠炎小鼠炎症因子，减轻结肠组织病理损伤[14]，通过调节降钙素基因相关肽减轻急性胰腺炎小鼠病理损伤[15]。本研究通过建立特应性皮炎小鼠模型，探讨吴茱萸次碱对该疾病的作用，结果显示，特应性皮炎小鼠耳部皮损组织结构缺失，明显水肿，可见大量炎性细胞浸润，皮炎评分升高，右耳明显增厚，吴茱萸次碱治疗后小鼠耳部皮肤组织结构较完整，细胞轻度水肿，少量炎性细胞浸润，皮炎评分降低，右耳厚度减小。免疫细胞Th1和Th2之间的平衡对于保持机体免疫功能稳定尤为重要，Th1/Th2失衡可导致多种疾病，如过敏性疾病和免疫失调[16-18]。已有研究发现，免疫细胞失衡与特应性皮炎密切相关[19]。IFN-γ是Th1细胞群分泌的主要细胞因子之一，IFN-γ可抑制IgE的合成，IgE水平与特应性皮炎小鼠皮损严重程度有关[20]。IL-4和IL-5是Th2细胞群分泌的主要细胞因子，二者可促进B淋巴细胞合成IgE[21]。此外，IFN-γ抑制Th2细胞群分泌IL-4和IL-5，抑制免疫细胞向Th2分化，使免疫细胞向Th1分化，阻断IgE合成，降低嗜酸性粒细胞表达和浸润[22]。本研究发现，特应性皮炎小鼠血清中IL-4、IL-5和IgE含量升高，而IFN-γ含量降低，吴茱萸次碱治疗后IL-4、IL-5和IgE含量降低，而IFN-γ含量升高，提示吴茱萸次碱可改善特应性皮炎小鼠病理症状，调节免疫平衡。

IL-4是诱导Th2细胞分化的关键调节因子，也是Th2细胞特征性细胞因子。STAT6是具有信号传递及转录因子双重功效的DNA结合蛋白，其核转位及转录活性由IL-4和IL-3调节，IL-4可使STAT6单体募集到IL-4受体的α链上，发生磷酸化，磷酸化后的STAT6二聚化转位入核，并结合于特定的DNA元件上，激活IL-4相关基因的转录及蛋白质合成[23]。SOCS1的表达活性由STAT6基因在转录水平上调节，参与下调IL-4受体活性，通过STATs通路参与Th细胞极化，在稳定Th1和Th2表型中具有重要作用[24]。eotaxin属于CC趋化因子成员，其受体是CCR3，主要作用于单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞等。研究发现，在A549肺癌细胞中，IL-4激活STAT6和eotaxin，促进癌细胞的炎症反应[25]。本研究检测特应性皮炎小鼠耳部组织中各蛋白变化发现，模型组小鼠耳组织中STAT6和eotaxin蛋白相对表达量升高，SOCS1蛋白相对表达量降低，而吴茱萸次碱低、高剂量组小鼠耳组织中STAT6和eotaxin蛋白相对表达量降低，SOCS1蛋白相对表达量升高，提示，吴茱萸次碱参与调节IL-4/STAT6/SOCS1/eotaxin信号通路。

综上所述，吴茱萸次碱可改善特应性皮炎小鼠症状，降低炎症反应，其机制可能与调控IL-4/STAT6信号通路有关，为临床治疗特应性皮炎提供理论依据。