高效液相色谱法测定饮料中10种合成着色剂和2种工业染料
2022-12-14梁培荣蔡海华林腾奕
◎ 梁培荣，蔡海华，张 敏，林腾奕
（广东省食品检验所（广东省酒类检测中心），广东 广州 510435）
食品的色泽一直是对食品质量进行评价的一种重要指标，而食品在生产、运输和储存等各环节中均会发生一定的化学或物理变化，导致食品的色泽发生一定程度的改变，因此厂家常使用色素来保持食品色泽。添加食用着色剂可维持食品的原色泽，其根据来源分为天然和合成着色剂。合成着色剂颜色更鲜艳、着色能力更强、着色更稳定持久且价格便宜，但其多以芳烃类化工品为原材料化合形成，作为一种化工产品，若长期食用对人体健康具有潜在危害[1-3]。
为了对合成着色剂进行监管，《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）中对食品合成着色剂的使用作出了规定，其中包括本次监测的柠檬黄、日落黄、新红、苋菜红、胭脂红、诱惑红、酸性红、赤藓红、亮蓝和靛蓝等。而酸性橙Ⅱ、酸性大红GR等工业染料具有高毒性，若与人体接触或被食用会具有“三致”等危害［4-6］。《关于印发全国打击违法添加非食用物质和滥用食品添加剂专项整治抽检工作指导原则和方案的通知》（食品整治办〔2009〕29号）将酸性橙等工业染料列为禁用的添加剂。
目前，常见的色素检测方法有高效液相色谱法[7-10]、毛细管电泳法、示波极谱法等[11-12]，其中高效液相色谱法因仪器灵敏度高、准确性高等优点得到广泛使用。目前，对于食品中禁用工业染料的测定方法的研究较多，多使用高效液相色谱法［13-14］。GB 5009.35—2016、GB/T 21916—2008和SN/T 1743—2006等标准中规定了部分着色剂的检测方法[15-17]。这些标准大多只检测一种或几种色素，前处理较为复杂，回收率不高，无法同时对多种着色剂和工业染料进行检测。因此，建立一种能同时测定工业染料和着色剂的高效液相色谱检测方法具有一定的参考价值。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
市场销售的某品牌饮料；柠檬黄、日落黄、新红、苋菜红、胭脂红、诱惑红、酸性红、赤藓红、亮蓝和靛蓝标准品（坛墨）；酸性Ⅱ标准品（阿尔塔）；酸性大红GR标准品（bepure）；甲醇（HPLC，美国Fisher公司）；乙酸铵（HPLC，国药集团化学试剂有限公司）；实验用水均为一级水。
1.2 仪器与设备
ACQUITY Arc高效液相色谱仪（配PDA检测器，美国Waters公司）；电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；超声波清洗器（昆山KQ-500DE型号数控）；高速冷冻离心机（Thermo Heraeus Multifuge X1R）；漩涡振荡器[艾卡（广州）仪器设备有限公司]。
1.3 实验方法
1.3.1 标准溶液的配制
准确称取适量固体标准品于50 mL容量瓶中用10%甲醇水溶解并定容至刻度，配制成混合标准溶液。其中，柠檬黄、日落黄、新红、苋菜红、胭脂红、诱惑红、酸性红、赤藓红、亮蓝、靛蓝和酸性大红GR配制成浓度为1.00 mg·mL-1的标准溶液；酸性橙Ⅱ配制成浓度为100 mg·L-1的标准溶液。
临用时用10%甲醇水逐级稀释成标准工作溶液。其中酸性橙Ⅱ浓度分别为 0.05 mg·L-1、0.10 mg·L-1、0.20 mg·L-1、0.50 mg·L-1、1.00 mg·L-1、2.00 mg·L-1和5.00 mg·L-1；其余组分浓度均为 0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、2.0 mg·L-1、5.0 mg·L-1、10.0 mg·L-1、20.0 mg·L-1和50.0 mg·L-1。
1.3.2 样品溶液的配制
准确称取5 g试样（样品含二氧化碳则先水浴加热除去二氧化碳）于50 mL带盖离心管中，加10%甲醇水15 mL涡旋混匀，超声20 min，以8 500 r·min-1离心5 min，转移至25 mL容量瓶中定容至刻度，摇匀。取适量上清液过0.45 μm滤膜，待高效液相色谱测定。
1.3.3 色谱条件
色谱柱：ChromCore C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A甲醇，流动相B乙酸铵溶液（0.02 mol·L-1）；流速：1.00 mL·min-1；进样量：10 μL；检测器：PDA检测器；检测波长：254 nm。流动相梯度洗脱程序见表1。
表1 流动相梯度洗脱程序表
2 结果与分析
2.1 前处理条件的选择
10种合成着色剂均为水溶性，酸性橙Ⅱ和酸性大红GR均易溶于水。样品通过10%的甲醇水溶液超声20 min后提取，再经离心后转移定容取上清液，经微孔滤膜过滤后进样，此操作前处理简单且回收率好。
2.2 流动相的选择
参考 GB 5009.35—2016方法，采用 20 mmol·L-1乙酸铵和甲醇的混合流动相体系，通过对洗脱条件的梯度优化，使12种组分获得较好的分离。优化后的梯度洗脱条件见表1。
2.3 色谱柱的选择
目前，关于食品添加剂的检测主要采用C18色谱柱[18-19]。本实验考察了不同品牌的C18色谱柱对目标化合物的分离效果。结果表明，在ChromCore C18色谱柱上各组分的色谱峰峰形尖锐对称，柱效高的同时分离度好，能在14 min内完成所有目标物的分离，满足快速检测需求。因此，选择ChromCore C1（8250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱进行检测。
2.4 柱温的选择
考察了柱温为30 ℃、35 ℃和40 ℃时对各组分的分离效果。在相同流动相和色谱柱条件下，随着柱温的变化，各组分的保留时间变化不大。但当柱温为30 ℃和40 ℃时，酸性红和亮蓝分离度较小。而柱温为35 ℃时各组分分离度好且峰形尖锐对称，故选择柱温为35 ℃。
2.5 空白溶剂对测定结果的影响
在相同的提取条件和液相条件下测定，12种组分10%甲醇试剂空白的色谱图和混合标准品的色谱图见图1。由图1可知，空白提取溶剂对各组分的含量测定未产生影响。
图1 10%甲醇溶液、12组分混合标准品色谱图
2.6 方法的线性范围与检出限
取配制好的12组分混合标准溶液，按优化后的条件进行分析，以浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），得到各组分的线性回归方程。检出限按3倍信噪比计算，结果见表2。由表2可知，各组分线性关系良好，相关系数均大于0.999，检出限为0.20 ～ 1.00 mg·kg-1。
表2 12种组分的线性回归方程、相关系数、线性范围和检出限表
2.7 方法的加标回收率和精密度
称取饮料空白基质样品，按照3个水平进行加标，平行测定8次，另外做2个空白平行，作空白扣除后，计算回收率和相对标准偏差，结果见表3。各组分平均回收率为90.73%～98.84%，相对标准偏差均小于5%。本方法的加标回收率和精密度均满足实际检测的要求。
表3 12种组分的回收率和精密度表（n=8）
3 结论
本方法建立了同时测定饮料中的10种合成着色剂和2种工业染料的高效液相色谱法，经验证本方法前处理简单、实验时间短、准确性和重现性好，适合于日常食品中液体样品中多种着色剂的测定，同时对国家标准中没有同时检测工业染料和着色剂的方法进行补充，为食品安全检测提供一定的参考。
