北京市肺结核病人耐药筛查实施效果的研究

陈双双, 代小伟, 田丽丽, 杨新宇, 赵琰枫, 陈 昊, 易俊莉, 张红伟, 王嫩寒, 李传友, 丁北川

据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)估算，2019年我国利福平耐药结核病患者数为6.5万例，占全球利福平耐药患者数的14%，位居全球第2位[1]。耐多药或利福平耐药结核病(multidrug/rifampicin-resistant tuberculosis，MDR/RR-TB)传播时间长、治愈率低、病死率高，给结核病控制带来极大的挑战[2]。近年来肺结核发病率位居北京市乙类传染病的首位，是首都重点防治的重大传染病，其中MDR/RR-TB的防治是我市乃至全国结核病控制的难点和重点问题。

根据《“十三五”全国结核病防治规划》要求，为进一步提高耐药肺结核患者的发现、治疗和管理水平，北京市开展所有病原学阳性肺结核患者的耐药筛查工作(具体筛查流程见图1)。为了解2019年北京市耐药结核病筛查方案实施以来的效果，及RR-TB患者对其他抗结核药物的耐药情况，以便进一步完善耐药结核病的快速筛查流程，本文对2019年北京市结核病防治机构及定点医院所有的结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)临床分离株进行比例法药物敏感性试验，从而为今后耐药结核病防治策略及治疗方案提供理论基础。

图1 北京市利福平耐药肺结核患者发现流程Fig.1 Identification process of patients with RR-TB in Beijing

1 材料与方法

1.1 资料来源 搜集北京市结核病防治机构及定点医院2019年1月至12月可疑肺结核病患者临床标本中分离的MTB 1 174株，进行3种抗结核药物[利福平(RFP)、异烟肼(INH)、左氧氟沙星(LFX)]的比例法药敏试验，筛选出RFP耐药株进行研究分析。采用回顾性研究的方法，分析RFP耐药的86株MTB对应的86例RR-TB患者诊疗实践过程中耐药筛查Xpert试验、Hain检测及比例法药敏试验的执行情况。所有菌株均经抗酸染色及PNB/TCH方法鉴定为MTB，同一例患者有多个样本时，只选取第1个样本进行试验及统计学分析。

根据中华人民共和国卫生行业标准 WS 196-2017[3]所有结核病患者，分为初治和复治。1)初治结核病患者：指初次发现肺结核且未接受抗结核药物治疗，或不规则抗结核治疗疗程<1个月的患者。2)复治患者：指不规则抗结核治疗≥1个月，或初治失败和复发的患者。3)按照《北京市耐药结核病的快速筛查流程》所有肺结核疑似病人(包括Xpert阴性培养阳性病人)，均需进行RFP耐药筛查, 本文中漏诊率是指：按照本研究比例法药敏试验结果得到的利福平耐药病人在临床诊疗中未被判定为RFP耐药的比例；漏筛率是指按照本研究比例法药敏试验结果得到的利福平耐药病人在诊疗过程中未进行RFP耐药筛查的比例。

1.2 仪器与试剂 GeneXpert技术反应盒及样品试剂均购自美国Cepheid公司。GenoType MTBDRplus ver 1.0试剂盒及GT-Blot 48杂交仪均购自法国生物梅里埃公司。所有改良罗氏培养基均购自河南赛诺特生物技术有限公司。

1.3 基因Xpert检测试验 Xpert检测参照产品说明书，将2 mL痰液根据标本性状加入1～2倍体积前处理液消化后放入检测试剂盒，由仪器2 h内自动报告是否检出MTB，以及利福平是否耐药。

1.4 线性探针MTBDRplus(简称Hain)检测试验 采用超声裂解法提取阳性培养物中的MTB-DNA。取5 μL提取后的DNA加入45 μL扩增混合物，按照说明书的扩增程序进行扩增。扩增完成后取20 μL扩增产物进行杂交，杂交过程包括化学变性、杂交孵育、洗涤、偶联和显色等。根据显色结果进行耐药情况的判读。判读标准：27个反应条带中，所有野生条带均显色且突变条带无显色时为敏感；野生条带缺失不显色或突变条带显色为耐药。

1.5 比例法药物敏感性试验 参照《结核病实验室检验规程》[4]培养阳性菌株均采用比例法进行药敏试验。药物浓度分别为INH(0.20 μg/mL)，RFP(40 μg/mL)，LFX(2 μg/mL)，对照培养基为中性改良罗氏培养基。 耐药百分比(%)=(含药培养基上生长的菌落数/ 对照培养基上生长的菌落数)×100%。耐药判定标准:若耐药百分比≥1% 时判定为耐药，<1%判定为敏感。

1.6 质量控制 每批药敏试验均利用标准株H37Rv进行质量控制。实验室每年参加中国疾病预防控制中心结核病参比实验室组织的药敏试验熟练度测试，成绩均为优秀。

1.7 统计学分析 使用Excel 2016软件进行数据收集和整理，SPSS 19．0软件进行数据统计分析。计数资料采用率表示，组间采用χ2检验及Fisher确切概率法，P<0.05为差异有统计学意义；两种检验方法的一致率=(观察符合例数/观察总例数)×100%。

2 结 果

2.1 培阳患者耐药筛查基本情况 2019年1-12月北京市19家结核病定点医疗机构共分离MTB 1 174株，全部进行比例法药敏试验筛出利福平耐药株为86株，利福平耐药率为7.33%(86/1 174)，其中初治患者为80.23%(69/86)。耐多药结核病(multidrug—resistant tuberculosis，MDR-TB)患者的分离株为64株，2019年北京市MTB耐多药率为5.45%(64/1 174)。

比例法药敏试验中利福平耐药株对应的86位患者Xpert试验及结果如表1， Xpert阳性病例与表型药敏试验利福平耐药检出的一致率为88.57%(62/70)，初复治在4组Xpert试验不同情况中差异无统计学意义(χ2=1.50，P>0.05)。

表1 Xpert试验在表型耐药RR-TB患者中的分布Tab.1 Distribution of Xpert test in patients with phenotype-resistant RR-TB

按照北京市耐药筛查流程，16例MTB分离培养阳性且Xpert试验结果为阴性或未进行Xpert试验，应取分离培养的MTB菌株进行快速Hain试验以补充筛查利福平耐药情况，其中有3例患者进行了Hain试验且结果为利福平耐药，86例RR-TB中经Xpert和Hain两种分子生物学方法快速筛查出65例，2例Xpert阴性和1例无Xpert结果后期培养阳性患者，取培养物进行了表型药敏试验，剩余10例未进行任何分子和表型方法的临床药敏筛查，漏筛率为11.63%(10/86)，详情见表2。2019年全年经耐药筛查工作发现RR-TB 68例，8例Xpert为利福平敏感而表型药敏为利福平耐药，以比例法药敏试验为金标准，通过耐药筛查工作RR-TB患者发现率为79.07%(68/86)，其中分子生物学方法RR-TB患者发现率为75.58%(65/86)，漏诊率为20.93%(18/86)。

表2 Xpert试验阴性及未进行Xpert试验的RR-TB中耐药筛查情况Tab.2 Screening of drug resistance in RR-TB with negative Xpert test and without Xpert test

2.2 MTB耐药性检测结果分析 1 174株MTB中比例法药敏检测肼耐药为144株，MDR为64株，异烟肼耐药菌株中MDR为44.44%，RR中MDR为74.42%。RR耐药株中MDR比例明显高于异烟肼耐药株，差异具有统计学意义(χ2=20.04，P<0.05)。

以表型药敏结果为金标准，根据2021年WHO最新发布的准广泛耐药(pre-extensive drug resistance tuberculosis，pre-XDR-TB)的新定义，符合MDR/RR-TB外，同时对任意氟喹诺酮类药品(包括左氧氟沙星、莫西沙星)耐药。86株RR临床分离株中LFX耐药为20株，准广泛耐药率为1.70%(20/1174)，在RR-TB中准广泛耐药率为23.26%(20/86)。初复治在3种不同耐药类型中差异无统计学意义(χ2=1.02，P>0.05)，见表3。

表3 不同耐药类型的分布情况Tab.3 Distribution of different resistance types

3 讨 论

北京市结核病防治机构及定点医院2019年利福平耐药株占全年MTB的7.33%，较2009年的9.5%[5]有所下降，远低于吉林省的17.23%[6]，这与上海地区相似[7]，说明我市RR-TB耐药状况处于较低水平且逐步改善。这可能与我市2011年起对疑似耐多药患者进行免费一二线抗结核药物药敏试验，从而制定针对性的治疗方案有关。

表型药敏耐药的86例RR-TB患者中，Xpert阳性检出MTB为70例，其中利福平耐药为62例，两方法利福平耐药检出的一致率为88.57%，高于广东地区报道的利福平耐药株rpoB的突变率81.5%[8]，低于国内外众多报道的90%～95%的突变率[9]。Xpert检测直接使用原始临床标本未分离培养，而分子生物学方法直接检测临床标本需耐药MTB含量高于20%以上才能检出[10-11]，而药敏试验为培养阳性的菌株，因此造成部分耐药MTB的漏检。本研究中有8例表型药敏结果为耐药而Xpert检测为敏感。有研究表明，rpoB基因RRDR区外存在影响MTB对利福平耐药的其他未知机制或者非ropB基因突变引起耐药[12]。另外，异质性耐药也是导致表型和基因型耐药检测结果不符的重要原因[13]。

按照北京市耐药筛查流程，分离培养阳性且Xpert阴性或未进行Xpert试验，应使用MTB菌株进行Hain试验以补充筛查利福平耐药情况，以便迅速获得RFP的耐药结果，尽快调整治疗方案，仍有3例未选择Hain试验而直接进行比例法药敏，由于表型药敏耗时长，在一定程度延误了耐药治疗方案的调整。另外10例分枝杆菌培养阳性未经过分子生物学耐药检测，漏筛率为11.63%。这提示我们各结防机构及定点医院对耐药结核病的重视程度不够，仍有部分病原学阳性患者未获得耐药结果，工作落实层面存在问题。部分结核病防治机构及定点医院对耐药筛查流程熟悉程度不够，贯彻执行力度不足，应继续加强市区各结防机构耐药筛查的督导与管理，从而进一步发挥Xpert联合Hain方法的分子生物学耐药检测的优势。

2019年通过耐药筛查检出RR-TB 68例，通过耐药筛查工作RR-TB患者发现率为79.07%，远高于同年我国RR-TB 28.7%的发现率[14]，但是仍然存在20.93%的漏诊率。主要存在技术层面和工作落实层面两方面的原因。首先，在技术方面存在着表型药敏与分子生物学方法结果不一致现象，另外在耐药筛查诊疗过程中工作机制有待完善，加强区县市级诊疗人员对耐药筛查重要性的认知，并定期开展督导检查。

北京市耐药筛查工作以Xpert方法为主的分子生物学快速耐药检测较传统培养物药敏试验，对RR-TB诊断时间大幅缩短，报告时间的中位数分别为1.0(0.0～7.0) d和 62.5(34.0～94.3) d，大大提高了耐药结核病的纳入治疗率[15-16]。其中通过Xpert试验检出RR-TB 62例，相比我市2018年以前仅对疑似耐多药患者药敏试验筛查中RR-TB数量大大增加，其中初治患者占82.26%，说明耐药MTB的传播是本市RR-TB的重要来源[17]。因此在北京特大人口城市中，早期开展Xpert检测，管理并治愈耐药结核病人，从而尽早降低其传染性是控制耐药结核病的根本策略。

RR耐药株中MDR占74.42%，异烟肼耐药株中MDR为44.44%，稍低于WHO报道的新发耐利福平结核病中78%为耐多药[1]。另外本研究显示RR-TB、MDR-TB、pre-XDR-TB中初复治比例差异无统计学意义，说明无论初治复治患者一旦检出利福平耐药应高度怀疑耐多药。因此建议临床参考利福平检测结果尽早开展主要抗结核药物的药敏试验，同时通过诊疗专家组讨论后确定诊断及治疗方案，从而大大减低耐药结核病的传播风险。

本研究RR-TB中LFX耐药株占23.26%，与魏淑贞等人报道的相似[18]，我国MDR/RR-TB患者对氟喹诺酮类药品的耐药率约25%，处于较高水平。氟喹诺酮类药物在MDR/RR-TB治疗中具有关键作用，现已作为利福平耐药肺结核的核心药物，若发生耐药会大大降低治疗效果，且影响短程和长程方案的选用[19]。若结果显示氟喹诺酮类药物敏感，优先采用短程化疗方案；若结果显示氟喹诺酮类药物耐药，则选用长疗程化疗方案治疗，后续再结合传统药敏检测结果调整化疗方案。因此，按照《中国结核病预防控制工作技术规范(2020年版)》要求，对MDR/RR-TB在治疗前应进行氟喹诺酮类药物的分子药敏检测，以给出精准治疗方案。MDR-TB治疗方案中A组药物贝达喹啉和利奈唑胺以及B组的氯法齐明较晚应用于结核病的治疗，耐药率较低，本研究对这3种药物的耐药性未涉及。

本研究存在一定的局限性。第一，本研究搜集的结防系统及定点医院就诊的患者以初治、病情稍轻、并发症较少的患者为主，可能对所有肺结核患者的代表性有限。第二，本研究所进行的分子检测及药敏试验，均没有进行重复验证，可能存在系统误差。第三，由于本研究未开展MTB对贝达喹啉、利奈唑胺及氯法齐明药物的表型药敏试验，对长疗程MDR-TB的治疗不能提供全面耐药信息。第四，常用于治疗肺结核的氟喹诺酮类药物主要包括LFX及莫西沙星(MFX)，本研究未进行MFX药敏试验，可能实际pre-XDR-TB的发病数稍高于现统计数。

综上所述，我市实施分子生物学方法为主的耐药筛查以来，RR-TB的发现显著增多，但仍有一定的漏筛率，应进一步加强管理和督促，以尽早降低MDR/RR-TB的传染性。另外，我市应尽早开展氟喹诺酮类药物的分子药敏检测，为耐药结核病的治疗提供精准的化疗方案。

利益冲突：无

引用本文格式：陈双双, 代小伟, 田丽丽, 等. 北京市肺结核病人耐药筛查实施效果的研究[J].中国人兽共患病学报，2022，38(11)：1018-1022. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.152