一起人间布鲁氏菌病聚集性疫情的病原学确诊及基因分型研究

聂守民，罗波艳，孙养信，范锁平，王文静，周地佳，孙 杰，常文辉，安翠红

布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌属(Brucella)细菌感染而引起的可在全世界范围内发生流行的、人兽共患的一种自然疫源性的传染性疾病，简称为布病[1]。人主要是通过直接接触受布鲁氏菌感染的病畜及其分泌物或病畜的肉、奶、皮毛等加工品经消化道、呼吸道、破损的皮肤黏膜等方式而被感染，感染以后会出现发热、多汗、乏力、关节疼痛等临床症状[2]；动物主要是通过交配或接触被布鲁氏菌感染的病畜污染的环境和饲料等经消化道、呼吸道、破损的皮肤黏膜等方式而被感染，感染以后会出现孕畜流产、公畜睾丸炎、跛行等临床表现[3]。人间布病是我国法定的乙类传染病，畜间布病是我国法定的多种动物共患的二类动物疫病[4]。布病不仅严重危害畜牧业的健康发展，阻碍社会经济的增长，更是危害人民群众身体健康、社会持续性稳定及公共卫生安全的重大威胁[5]。

2020年3月，陕西省咸阳市三原县发生一起人间布鲁氏菌病家庭聚集性疫情，本实验室在2名患者血液内分离到2株布鲁氏菌，利用MLVA16方法进行分型鉴定，为陕西省内首次发现的新基因型。

1 材料与方法

1.1 流行病学调查 对2名患者进行个案调查，每位患者采集2份静脉血，用于虎红平板凝集试验(RBT)、试管凝集试验(SAT)及双相血培养瓶培养。

1.2 仪器设备 生物安全柜(赛默飞世尔科技公司)，恒温生化培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)，金属浴(杭州米欧仪器有限公司)，高速离心机(赛默飞世尔科技公司)，PCR扩增仪(苏州东胜兴业科学仪器有限公司)，水平电泳仪(北京六一生物科技有限公司)，凝胶成像仪(美国伯乐公司)，ABI3730测序仪(赛默飞世尔科技公司)，立式蒸汽高压灭菌锅(山东新华医疗器械股份有限公司)。

1.3 试剂耗材 虎红平板凝集抗原(兰州生物所)，试管凝集抗原(兰州生物所)，双相血培养瓶(贝瑞特生物技术(郑州)有限责任公司)，单项特异性血清A、M(青岛中创汇科生物科技有限公司)，菌种保藏管(上海宝录生物科技有限公司)，细菌核酸提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)，超纯水(北京索莱宝科技有限公司)，2×PCR扩增混合液(2 × TSINGKE Master Mix，北京擎科生物科技有限公司西安分公司)，PCR用管(上海百赛生物技术股份有限公司)，琼脂糖(赛默飞世尔科技公司)，5×TBE电泳缓冲液(赛默飞世尔科技公司)，DNA染料(赛默飞世尔科技公司)，DNA Marker(100 bp Plus DNA Ladder Marker，北京全式金生物技术有限公司)。

1.4 实验室检测方法

1.4.1 血清学检测 采用虎红平板凝集试验进行血清学初筛，试管凝集试验进行血清学确诊，按照国家布病诊断标准进行结果判定，血清滴度≥1∶100(++)为阳性结果。

1.4.2 病原学检测 取患者5～10 mL静脉血无菌注射到双相血培养瓶内，放置在37 ℃恒温生化培养箱内，培养时间为7～21 d。出菌后安全转移至三级生物安全实验室，在生物安全柜内用接种环挑取菌落至培养皿内进行纯化培养。利用单项特异性血清A、M凝集试验进行菌株种型鉴定。

1.4.3 核酸检测 在生物安全柜内用10 μL接种环挑取半环纯菌至提前加有300 μL超纯水的Ep管中混匀，放置在金属浴中80 ℃持续30 min。按照细菌核酸提取试剂盒操作说明进行核酸提取。采用BCSP31-PCR从菌属水平上对菌株进行鉴定，扩增出223 bp目的片段即为布鲁氏菌属；采用AMOS-PCR从菌种水平上对菌株进行鉴定，扩增出731 bp目的片段即为羊种布鲁氏菌(羊种1型、羊种2型或羊种3型)。引物设计、反应体系及扩增程序均参照文献[6]进行。分离菌株种型鉴定要根据单项特异性血清A、M凝集结果及核酸检测结果进行综合判定。

1.5 分子分型

1.5.1 多位点序列分析(multilocus sequence typing，MLST) MLST方法选择9个布鲁氏菌基因片段(gap、aroA、glk、dnaK、gyrB、trpE、cobQ、int-hyp、omp25)作为靶标基因。9对引物设计、反应体系及扩增程序均参照文献[7-8]进行。扩增产物送北京擎科生物科技有限公司西安分公司进行双向测序，通过比对序列，获得分离菌株的基因序列型及MLST基因型。

1.5.2 多位点可变数目串联重复序列分析(multi-variable-number tandem repeat analysis，MLVA) MLVA通过16个基因位点对分离菌株进行分型。16对引物设计、反应体系及扩增程序均参照文献[9-10]进行扩增产物送北京睿博兴科生物技术有限公司进行毛细管电泳进行扩增产物长度检测，通过比对片段长度得到串联重复数。登录MLVAbank for Microbes Genotyping (https://microbesgenotyping.i2bc.paris-saclay.fr/)，将所得串联重复数与数据库进行比对，从而确定分离菌株的MLVA基因型。

1.5.3 聚类分析 用Excel汇总本研究分离菌株与陕西省其他分离菌株、国内外部分参考菌株的MLST分型数、MLVA16分型数，利用BioNumerics(Version7.6)软件，通过UPGMA(平均连锁聚类法)对分离菌株进行聚类分析，用最小生成树(Minimum spanning tree)进行高级聚类分析。

2 结 果

2.1 疫情概况 首发病例赵某，男，48岁，陕西省咸阳市三原县人，农民，主要从事奶羊养殖工作。患者自述2020年2月26日出现乏力症状，3月2日出现膝盖疼痛症状并伴有发热，体温38.5 ℃，自行服用酚氨咖敏胶囊后症状缓解，3 d后发热反复，自觉乏力及膝关节疼痛；患者李某，女，49岁，为首发病例赵某的妻子，农民，主要从事奶羊养殖工作。患者自述于3月15日出现乏力症状病伴有指关节、膝关节轻微疼痛。3月27日，2人一同前往医院就诊，诊断为布鲁氏菌病。通过流行病学调查得知赵某家有2只奶羊于2020年1月15日出现流产，夫妻2人在处理流产物时未采取有效防护措施。患者对布鲁氏菌病的知晓程度不高，在日常的养殖过程中不注重个人防护，奶羊圈养环境较差。

确诊后随即对两名患者建立了治疗档案并定期进行随访，督促患者足量、足疗程用药，同时对患者居家环境及奶羊圈养环境进行了终末消毒，对病例同村村民进行了布病防治知识宣传。由于患者确诊及时，尚处在布鲁氏菌病急性期，现已痊愈。

2.2 实验室检测结果

2.2.1 血清学检测结果 夫妻2人虎红平板凝集初筛试验和试管凝集确诊试验结果均为阳性：赵某为1∶400(+++)，李某为1∶200(++)。

2.2.2 病原学检测结果 2020年3月27日采集夫妻2人血液进行培养，赵某的双相血培养瓶于4月2日出现菌落，编号为SN2020.2；李某的培养瓶于4月3日出现菌落，编号为SN2020.4。经单相特异性A、M血清凝集试验，2株分离菌株的结果均为A不凝集，M凝集(A-，M+)。该结果表示分离菌株可能是羊种1型布鲁氏菌或牛种4、5、9型布鲁氏菌。

2.2.3 核酸检测结果 2株分离菌株的核酸经BCSP31-PCR扩增后出现223 bp的片段，证明分离菌株属于布鲁氏菌属；经AMOS-PCR扩增后出现731 bp的片段，证明分离菌株是羊种布鲁氏菌，结合A、M血清凝集试验结果，判定2株分离菌株为羊种1型布鲁氏菌。

2.3 MLST结果 2株分离菌株MLST9个位点gap-aroA-glk-dnaK-gyrB-trpE-cobQ-(int-hyp)-omp25的序列号为3-2-3-2-1-5-3-2-8，MLST基因型确定为ST8，与陕西省分离菌株的ST型相同。

2.4 MLVA结果 2株分离菌株的16个串联重复序列位点Bruce06-Bruce08-Bruce11-Bruce12-Bruce42-Bruce43-Bruce45-Bruce55-Bruce18-Bruce19-Bruce21-Bruce04-Bruce07-Bruce09-Bruce16-Bruce30的基因型为1-5-3-8-2-2-3-2-4-41-8-4-4-3-5-5。分析发现，该基因型在12位点VNTR结果为8，与陕西省其他菌株(结果为13)不一致。通过查询布鲁氏菌的MLVA数据库，该2株分离菌株的基因型为首次发现，panel 1基因型命名为8-N1型，MLVA11基因型命名为11-N1型[11]。

2.5 聚类分析结果 MLST聚类分析见图1，MLVA聚类分析见图2，MLVA高级聚类分析的最小生成树见图3。

3 讨 论

布鲁氏菌病是我国法定的乙类传染病，同时也是法定的二类动物疫病。传染源一般在畜间，如果不能及时发现很容易造成人间布病疫情的发生。布鲁氏菌病的病死率很低，但是急性期如果未能及时发现、诊断和治疗，将会转变成迁延不愈的慢性布鲁氏菌病，会严重危害患者的身心健康并造成非必要的经济损失。畜间布鲁氏菌病发生会阻碍畜牧业及社会经济的良好发展，同时也是对公共卫生安全的一种威胁。因此，要加强对布鲁氏菌病的监测，及时发现报告病例，尽早控制疫情的蔓延。

三原县隶属于陕西省咸阳市，位于关中平原中部，是咸阳市大力发展千亿级奶山羊产业链的主要县(区)之一。随着奶山羊养殖业的快速发展，散养户数量及羊只存栏量急剧上升，畜间及人间布鲁氏菌病的防控压力增大。三原县东与临潼、富平、阎良相接，西与泾阳、淳化相连，北与耀州相邻，南与高陵相靠，四周接壤的都是布病高发的县区，因患病羊只的肆意流动导致布鲁氏菌病疫情的风险增大。本次家庭聚集性疫情就是由于奶羊散养户在日常养殖过程中及处理流产物时没有采取有效个人防护造成的，散养户作为布鲁氏菌病的高危人群缺乏对该传染病的知晓，在今后的防控工作中应该加强对高危人群的健康教育工作，大力普及布鲁氏菌病的防治知识，增强散养户等高危人群的防护意识。

虎红平板凝集试验(RBT)和试管凝集试验(SAT)在基层使用广泛，能够为临床诊断提供支持，对布鲁氏菌病疫情的早发现具有重要的意义。本次疫情分离得到的两株布鲁氏菌经血清凝集实验及核酸检测鉴定为羊种1型，而陕西省多年来流行的主要种型为羊种3型，结合患者临床症状及流行病学分析未发现两种不同型别的羊种布鲁氏菌引起的疫情有所区别，但陕西省多年来未有关于羊种1型布鲁氏菌疫情的报道，所以本次疫情值得进一步研究分析。

图1 MLST聚类分析图Fig.1 MLST cluster analysis diagram

注：框选部分为本次疫情的分离菌株信息。图2 MLVA聚类分析图Fig.2 MLVA cluster analysis diagram

图3 MLVA分型最小生成树Fig.3 Minimum spanning tree of MLVA

对分离菌株进行分子分型也是一项很重要的工作，能对疫情的判定及流行病学溯源等提供有力的支持。传统分型鉴定具有操作繁琐、实验周期长、生物安全要求高、易发生实验室感染等诸多不足，已经不能满足当前布鲁氏菌病的防控需要。多位点序列分析(MLST)、多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)都是基于PCR技术对细菌进行基因分析的分子生物学技术[12-13]，在分子分型方面发挥越来越重要的作用。三原县的2株布鲁氏菌分离株的MLST结果显示与陕西省其他菌株的ST型一致，与新疆、内蒙、福建、土耳其分离的羊种3型菌有较近的进化关系，与青海、海南分离的羊种1型菌遗传进化关系较远，说明生物型相同的菌株其基因型别可能存在很大的差别。MLVA结果显示本次疫情分离得到的菌株基因型为首次发现，丰富了陕西省布鲁氏菌的基因库；在全国范围内未发现存在与本次疫情分离株基因型近源的菌株；同时分型结果还表明不同疫情分离的菌株各自成簇，同一疫情分离的菌株具有同一基因型，说明同一疫情的不同个体之间存在相同的传染源。经过分子分型研究，结合流行病学分析，本次聚集性疫情确定为本地发生的，但是菌株间的突变进化关系还需要进一步的研究。

为做好全省的人间布鲁氏菌病的防控工作，建议市级疾控中心能够掌握布鲁氏菌的分子分型技术，建立各市的布鲁氏菌分子分型数据库。

利益冲突：无

引用本文格式：聂守民，罗波艳，孙养信，等. 一起人间布鲁氏菌病聚集性疫情的病原学确诊及基因分型研究[J]. 中国人兽共患病学报，2022，38(11)：1007-1011. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.154