宏基因二代测序在肺部感染中的诊断效能研究进展

吴 娜 李永霞

1.宏基因二代测序概况

宏基因二代测序(metagenomic Next-Generation Sequencing，mNGS)，也叫作高通量测序,是利用通量较高的二代测序技术对送检样本中所有微生物基因独立或并行测序，测序深度大、覆盖面广、运行效率高。目前mNGS成本下降了近50000倍，而测序数据量增加1000倍左右[1]，促进了其在医学领域的广泛利用。mNGS目前可用于病原微生物的鉴定、医院感染性疾病暴发的调查、未知病原体的检测、毒力分析、耐药基因组的研究等方面[2～4]。2008年Palacios等[5]采用宏基因组发现了新发病原体沙粒病毒，2011年Xu等[6]相继采用宏转录组发现新型布尼亚病毒，开启了mNGS技术在感染中应用的先例。在2014年，CY Chiu教授[7]应用mNGS成功诊断了不明原因发热的14岁男童罹患钩端螺旋体，Wilson将此病例发表，mNGS成为肺部感染病原学诊断的研究热点，也应用于其他系统包括中枢神经系统感染[8]、感染性心内膜炎[9]、感染性胰腺坏死[10]、人工关节感染[11]等。肺部感染作为感染性疾病中发病率最高的疾病，也成了mNGS应用最广泛的领域。

2. mNGS在肺部感染不同病原体中的诊断效能

2.1 细菌 肺部感染80%以上为细菌感染。肖光荣等[12]研究表明革兰阴性菌占76.7%，革兰阳性菌占16.1%，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)占革兰阳性菌的73.8%。排名前五位的分别为肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、大肠杆菌、流感嗜血杆菌。肺部细菌感染病原学诊断的金标准为传统培养和涂片镜检，但病原菌检出阳性率低且培养耗费时间较长。mNGS技术为肺部感染病原学诊断提供新的方法。李思云[13]的研究共纳入44例患者，其中22例为细菌感染，mNGS诊断细菌阳性率为81.82%高于传统方法(63.64%)，P>0.05。这一结果表明mNGS在诊断细菌感染方面阳性率高于传统培养，但差异不明显。Ying Li[14]等人的研究得出，在细菌诊断方面mNGS对比培养法灵敏度及特异度分别为88.89%及74.07%，mNGS对比涂片法的灵敏度及特异度是100%及77.78%。钮月英[15]等的研究比较了mNGS与传统培养检测的病原体分布发现，仅有鲍曼不动杆菌传统培养检出例数较mNGS多，而肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌等其他细菌mNGS检出例数明显多于传统培养。除阳性率高之外，mNGS检测结果不受使用抗生素的影响，潘春熹[16]等的研究表明检测前未使用过抗生素组两方法检出率无明显差异，而检测前使用抗生素大于3天组mNGS阳性率显著高于传统培养。由此可见，在诊断细菌方面mNGS优于传统培养和涂片镜检，但特异性不高。在未来的研究中，mNGS为新型诊断技术研究和药物研发提供有力的支持，利用mNGS检测微生物表达产物的RNA-seq读数可以把感染、定植和活菌与死菌区别出来,实现精准诊断，还可以通过监测耐药菌基因变化找到突变位点，对后期耐药菌抗生素的研发有指导意义[17]。

2.2 厌氧菌 不明原因的肺部感染中，厌氧菌占据不可忽视的地位，而且厌氧菌感染是引起感染性休克的主要原因之一[18]。传统检测方法为厌氧培养，由于厌氧菌生长条件极为苛刻，培养阳性率低。李冰[19]等关于mNGS对厌氧菌感染精准化诊断的研究表明，菌属水平最常见的菌属为普氏菌属、梭杆菌属、卟啉单胞菌属，菌种水平最常见的菌种为中间普氏菌和具核梭杆菌。该研究纳入16例患者共29份微生物标本，分别同时进行厌氧菌培养和mNGS检测，结果显示肺部感染厌氧菌培养阳性率为7.14%(1/14)，而mNGS检测阳性率为71.43%(10/14),P=0.001,两者间存在显著统计学差异；从微生物标本送检至结果报告，培养所需平均时间为(81.27±7.94)h，约为mNGS检测所需的平均时间[(39.66±15.09)h]的2倍(P<0.05)。因此，mNGS在厌氧菌感染的快速、精准化诊断中具有明显优势。

2.3 病毒 上呼吸道感染病原体绝大多数为病毒，而下呼吸道病毒感染比较隐匿，常常与细菌、支原体等混合感染。部分病毒传染性及致病力极强，例如SARS冠状病毒导致的重症急性呼吸综合征、MRES-CoV导致的中东呼吸综合征等。其他常见的病毒有单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、腺病毒等。目前病毒感染检测方法有抗原检测、RT-PCR、病毒分离、血清特异性IgG及IgM抗体测定等，血清特异性抗体测定是诊断的金标准。然而，目前检测方法只能检测已知的目标病原体，无法识别新发、变异的病毒。mNGS技术能够检测到样本中所有的病毒基因序列，从而识别出新型病毒，还能够通过比对基因序列找到变异位点，协助寻找中间宿主及病毒起源[20]。此外，对于其他常见病毒mNGS阳性率高于传统方法。李思云[13]研究纳入44例不明原因肺部感染患者，有13例为病毒感染，mNGS阳性率为84.62%(11/13)，而传统方法阳性率仅为38.46%(5/13)，P<0.05，可认为mNGS诊断病毒阳性率明显优于传统方法。马彩霞[21]等的研究将47例确诊儿童重症支原体肺炎的支气管肺泡灌洗液同时进行传统病原检测和mNGS，结果47例患者两种方法肺炎支原体检测均为阳性，不同的是mNGS 23例(48.9%)检出混合感染，而传统检测仅2例(4.3%)检出混合感染，mNGS检测出混合感染最多的病原体为腺病毒7型(11例，23.4%)，而传统检测仅1例腺病毒抗原呈现弱阳性。mNGS不仅检测病毒阳性率高，还能够通过序列数判断肺部病变严重程度。缪青[22]等关于mNGS检测呼吸道病毒的临床应用研究得出，RPKM参数(每100万个序列每100bp，匹配上的序列数)与PO2、CD4/CD8比值呈负相关，而与肺部病变严重程度呈正相关。由此可见mNGS对病毒感染及病毒混合感染具有很显著的优势，且基因序列能早期进行病毒分型，检测序列数可分析病毒载量评估病情。

2.4 真菌 肺部真菌感染常继发于免疫功能低下人群，老年人合并基础疾病、艾滋病及使用抗生素、抗肿瘤药物、免疫抑制剂等是其高危因素。近年来肺部真菌感染的发病率及病死率逐年上升[23]，mNGS提高了真菌感染检出率。李思云[13]研究纳入44例不明原因肺部感染患者，有14例为真菌感染，mNGS阳性率为85.71%(12/14)，传统方法阳性率50%(7/14)，P>0.05。与此结果相近的是，李荷兰对肺活检组织进行mNGS的研究得出，mNGS对比涂片法诊断真菌的灵敏度及特异度分别是62.5%及66.7%，mNGS对比培养法诊断真菌的灵敏度及特异度是57.1%及61.5%。上述研究表明，mNGS诊断真菌阳性率高于传统方法，但差异不具有统计学意义。然而，mNGS在诊断肺曲霉病(PA)和肺孢子菌肺炎(PCP)方面具有显著优势。贾建超[24]等的研究纳入17例传统病原学检测确诊真菌感染及3例符合真菌感染临床诊断患者，收集20例患者肺泡灌洗液行mNGS检测，20例患者均为阳性，3例符合临床诊断患者中1例确定为肺孢子菌感染合并白色念珠菌，另外2例为肺孢子菌合并鲍曼不动杆菌感染；传统方法仅检出3例曲霉菌，而mNGS检出6例。另外，顾鹏[25]等的研究选取肾脏疾病使用免疫抑制剂治疗后疑诊肺孢子菌肺炎(PCP)的患者37例作为实验组，确诊其他病原体所致肺部感染者25例作为对照组，实验组和对照组均进行mNGS检测，结果实验组35例患者mNGS检出耶氏肺孢子菌，敏感度为94.59%，特异度为100%，而G试验+GM试验的敏感度及特异度分别为89.19%及56.0%，对照组25例患者均未检出耶氏肺孢子菌。这一研究结果表明,mNGS是诊断肺孢子菌肺炎高效而准确的方法，梁艳[26]等的研究结论此一致。还有，张尧[27]等的研究以最终诊断为慢性肺曲霉病为金标准，比较了传统培养、血清烟曲霉特异性抗体Ig G测定、mNGS三种方法的灵敏度、特异度及ROC曲线下面积，结果三者ROC曲线下面积分别为0.759、0.696、0.608，灵敏度mNGS(65.7%)>血清烟曲霉特异性抗体Ig G测定(48.6%)>传统培养(28.6%),特异度传统培养(93.0%)>血清烟曲霉特异性抗体Ig G测定(90.7%)>mNGS(86.0%)。由此可见，mNGS对肺孢子菌及曲霉菌检出率显著优于传统方法，且检测肺孢子菌特异度较高即较为准确，检测曲霉菌特异度不如传统培养及血清特异性抗体测定。

2.5 结核 根据世界卫生组织2020年10月14日发布的全球结核病年度报告，我国2019年新发结核病患者数约83万例，位居全球第三位；利福平耐药结核病患者数约6.5万例，占全球利福平耐药肺结核患者的14%，位居全球第二位，是全球结核感染负担最重的国家之一。肺结核在结核病中占比最多，而最近流行病学调查发现，肺外结核的比例不断增多[28]。临床中由于结核培养阳性率低，病原学诊断十分困难，结核诊断常借助痰涂片查抗酸杆菌、T-SPOT、PPD试验等辅助检查。对于涂片及培养多次阴性即所谓“涂阴”及“菌阴”的患者，常常依据临床医生的经验结合胸部CT典型的影像学表现进行临床诊断或诊断性抗结核治疗。目前病原学确诊结核的方法有传统培养、GeneXpert MTB/RIF分析法。Peixin Chen[29]等人的研究比较了传统培养、GeneXpert MTB/RIF、mNGS三种方法诊断结核的效能，结果mNGS诊断结核的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、约登指数分别为66.7%、97.1%、96.0%、73.3%、63.8%，灵敏度mNGS(66.7%)>GeneXpert MTB/RIF(61.5%)>传统培养(36.1%)；以传统培养作为金标准，mNGS的约登指数为88.2%，以GeneXpert MTB/RIF为金标准，mNGS的约登指数为100%，说明mNGS在确诊结核方面与现有方法一致性较好。这一结论与Zhou X[30]等人的研究结果一致，即mNGS与GeneXpert MTB/RIF灵敏度相差不大，但显著高于传统培养。综上所述，mNGS是目前检测结核灵敏度和特异度最高的方法，且可缩短诊断时间，提高检测效能。

mNGS的优势还在于区分结核与其他抗酸杆菌，抗酸杆菌包括结核杆菌(TB)、麻风杆菌和其他非结核分枝杆菌(NTM)，痰涂片查抗酸杆菌不能区分上述三者，因此临床中非结核分枝杆菌感染常常被忽视,而部分NTM也被误诊为结核。有文献表明，亚洲人群NTM的发病率约为39.6例/10万人年，仍以19例/10万人年的速度增长，NTM感染已超过TB[31]。然而，复旦大学附属中山医院的一项研究显示NTM的确诊率仅为40%左右。由此可见，非结核分枝感染形势严峻，快速准确诊断NTM是有效诊治的关键。缪青[32]等研究表明，传统培养检测NTM阳性率为21.9%，mNGS检测 NTM阳性率24.7%，P=0.29，二者之间无明显差异。因此，mNGS在检测NTM方面优势不明显，但mNGS检测时间仅为传统培养的一半，可早期确定菌种进行诊治，有利于区别结核与其他分枝杆菌感染。

2.6 其他病原体 阅读文献发现，mNGS还对肺炎支原体、鹦鹉热衣原体等非典型病原体感染诊断具有显著优势。肺炎支原体培养要求较一般细菌高，而鹦鹉热衣原体甚至需要细胞培养技术，因此目前临床上多采用微量免疫荧光法测血清特异性Ig M抗体进行诊断。马彩霞[21]等的研究将47例确诊儿童重症支原体肺炎的支气管肺泡灌洗液同时进行传统病原检测和mNGS，结果47例患者mNGS肺炎支原体检测均为阳性，与肺炎支原体PCR检测完全符合，且mNGS检测肺炎支原体合并其他病原体感染的检测效能优于传统培养。骆煜[33]等对通过mNGS诊断为鹦鹉热衣原体肺炎的5个病例进行个案报道，5个病例均以高热、咳嗽收住院，且都有鸟类或家禽接触史，胸部CT都为单个肺叶的渗出实变，个别病例甚至出现呼吸衰竭，入院后急行mNGS检测，发现鹦鹉热衣原体序列而确诊，及时调整抗生素为四环类药物后病情好转，缩短了鹦鹉热衣原体感染的诊断时间和病程，有效减少了抗生素的滥用误用。黄美霞[34]等报道了一例以“咳嗽伴胸痛”为主诉入院的12岁男孩，CT提示右肺中叶实变不除外空洞形成，肺泡灌洗液DNA检测阳性，但灌洗液结核涂片、结核感染T细胞检测及结核菌素试验均阴性，肺结核证据不足，最终通过mNGS确诊了格雷文尼放线菌感染，调整治疗后患者病变吸收好转。目前对于非典型病原体的诊断多集中在个案报道，期待在未来更多的研究中体现mNGS对非典型病原体的诊断价值。

3.总结与展望

mNGS可大大提高肺部感染病原体诊断效率。在细菌感染方面，mNGS灵敏度和特异度均高于传统培养，但差异不明显，而对于厌氧菌则具有显著差异；在病毒感染方面，mNGS可检测出传统方法不能识别的新型或未知病毒，可追溯病毒起源及监测变异，且对于病毒混合感染具有很高的检出率，mNGS在病毒感染方面具有十分显著的优势；对于真菌感染，mNGS在诊断肺曲霉病(PA)和肺孢子菌肺炎(PCP)方面具有显著优势；在结核感染方面，mNGS灵敏度明显优于传统检测，且能够区分结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌感染，mNGS联合传统检测可提高灵敏度；此外，mNGS对于检测支原体、鹦鹉热衣原体、肺放线菌等非典型病原体也具有绝对优势。

目前mNGS的不足之处有以下方面：①费用较高，临床可及性有待提高；②文库制备缺乏统一、全面、准确的参照数据库，少见、罕见的病原体可能漏诊；③对于有细胞壁保护的胞内菌检测灵敏度有望通过有效的破壁处理进一步提高。期待随着mNGS技术的改进，进一步提高其在肺部感染中的诊断效率，更加有效的应用于临床。