电针联合骨髓间充质干细胞移植修复脊髓损伤的研究浅析*

郭智超 孙忠人 尹洪娜

（1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150006）

脊髓损伤（SCI）在中医学中没有明确的对应病名，但是其症状与“痿病”相近，所以通常将脊髓损伤归于“痿病”一类，也有专家称为“体堕”。胥林波认为，督脉与脊髓关系密切，不仅生理功能联系紧密，病理影响也相互依存。督脉循行于人体背部，为“阳脉之海”，具有调节全身阳经经气的作用。当督脉受到损伤后，会出现气血瘀阻，产生全身麻木、活动受限的症状［1］。

急性SCI是指各种原因导致的脊髓结构功能的损害，损伤平面以下感觉、运动功能障碍，可分为原发性和继发性两种。原发性SCI是指当脊髓受到外力作用后的损伤［2］。继发性SCI是指损伤后由于多种原因造成的二次损伤，主要与损伤部位的微循环有关，包括过度的促炎症反应、脊髓细胞的死亡、凋亡、脂质过氧化等［3］。

电针作为一种具有显著疗效的非手术治疗方式，具有副作用小、效果明显、经济安全等优点，在临床中被广泛应用。目前有许多研究表明，电针具有抑制受损脊髓组织细胞的凋亡、促进神经生长因子（NGF）的表达、抑制血栓的生成、促进脊髓屏障中血管内皮的再生等作用［4］。但电针治疗SCI的治疗机制还有待深入研究。

使用干细胞的目的在于通过引导轴突生长来维持和重新髓鞘化、促进损伤和存活神经元的营养供应以及加速脊髓自身细胞的增殖来恢复组织基质［5］。间充质干细胞作为干细胞的一种，是具有自我更新和多向分化的基质细胞，被称为“万能细胞”。可以从多种组织中进行分离，如脐带、骨髓、脂肪组织等，并且可以分为多个亚群，这些亚群不仅和某些细胞谱系的分化有关，而且和本身的再生能力有关。即使是同一组织内也会因炎症变化，分离分化而产生不同。正因为这些部位容易获取且治疗效果明显，逐渐应用于实验和临床中［6-7］。BMSCs移植作为临床中广泛应用的一种干细胞移植手段，具有来源广、分化能力强、稳定性好等优点［8］。本文就电针联合BMSCs移植对SCI的修复机制及时间效应进行浅析。

1 电针治疗SCI机制研究

电针在镇痛、改善神经元功能、抑制细胞自噬、焦亡、凋亡、铁死亡［9］和炎症等相关通路进行修复SCI方面的作用中得到了广泛的证实［10］。姚梦莉等研究发现选用双侧悬钟、阳陵泉两个穴位进行电针治疗可以提升白细胞介素-1受体拮抗剂（IL-1Rα）的含量，降低肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-β（IL-1β）及白细胞介素-6（IL-6）的表达进行抗炎，减少继发性SCI的损害［11］。同时使用不同的波形对于SCI的治疗机制也会产生差异。有研究表明，使用疏密波进行电刺激能够使对运动神经起营养支持作用的神经营养因子-3（NT-3）含量增加，加快SCI的逆转运速率，同时使TrkC受体、mRNA的表达水平均明显提升［12］，并且疏密波还可以促进SCI的血液循环，提升超氧化物歧化酶（SOD）活性，并显著降低丙二醛（MDA）含量，从而避免自由基及其代谢产物对损伤部位的损害，改善神经组织，使新陈代谢加快，加速炎症吸收［13］。有学者发现，当使用断续波进行电刺激时，不仅可以加速受损部位炎症的减退，促进局部坏死和崩解产物的消除，使局部微循环得到改善，神经髓鞘及其细胞核不断增多，从而促进神经的再生，并且断续波还可以使损伤部位失去神经控制的肌纤维进行主动性收缩，逐渐恢复肌细胞固有的收缩和舒张特性，减慢因失去神经支配后肌蛋白的变性过程，进而促进SCI的恢复［14］。

2 BMSCs治疗SCI机制研究

2.1 BMSCs保护机制

SCI可分为两个阶段，即初级阶段和二次损伤阶段。在大多数的情况下，原发性损伤后的继发阶段更为重要，是防治损伤传播的治疗靶点。当二次损伤发生后，会加重组织损伤、细胞膜内外失衡、神经元细胞凋亡和血脊髓屏障被破坏等，最终造成脊髓神经功能丧失，并伴随SCI中持久的胶质和纤维化疤痕的发展［15］。

2.1.1 抗炎 巨噬细胞主要有M1型和M2型两种，M1型巨噬细胞是典型的促炎细胞，通过糖酵解进行吞噬和杀伤，在脊髓损伤初期向组织集合，逐渐形成瘢痕组织。M2型巨噬细胞的特性是产生抗炎因子，依赖氧化磷酸化（OXPHOS）持续产生能量进行组织修复。BMSCs能有效地为损伤部位进行抗炎，张继峰等［16］发现骨髓间光质干细胞能够减少脓毒症大鼠炎性细胞浸润，M2巨噬细胞数量明显降低，调控肺泡巨噬细胞NF-κB（P65）蛋白入核，即损伤发生后，通过BMSCs和MSR1联合有助于增强M2极化表型进行抗炎。另外有实验表明通过提取BMSCs的外体（BMSC-Exos）对已经建模肌腱骨损伤的小鼠进行组织学、免疫荧光以及PCR定量实验发现，BMSC-Exos可以抑制细胞凋亡，诱导M2型巨噬细胞极化，分泌过量的抗炎因子，加速骨质的愈合［17］。

2.1.2 抗氧化 氧化应激是指当机体受到刺激后产生过量的活性氧，导致与抗氧化防御系统平衡状态失衡，引起机体损伤［18］。SCI后氧化应激的出现导致：1）细胞膜结构遭到破坏，内外离子失衡，导致神经功能紊乱；2）线粒体抗氧化功能受损，导致运动神经元死亡；3）加速谷氨酸释放速度，增加运动神经元对兴奋性毒性的敏感性等多种继发性损害［19-21］。实验表明，将BMSCs移植到SCI部位后进行观察有明显改善，BBB评分3 d后开始降低并持续恢复，作为氧化应激标志性指标的SOD活性提升，损伤部位的抗氧化能力持续增强［22］。Kyan在实验中将培养后的BMSCs血清直接注射SCI处发现，与其他组相比，本组氧化应激代谢物的产量明显降低，BMSCs对氧化应激水平降低，能够最大限度地减少对轴突的二次损伤程度［23-24］。

2.1.3 抗细胞凋亡 细胞凋亡作为细胞死亡方式的一种，是为了维持机体神经系统正常发育、保持细胞数量动态平衡的一种必要过程，是一种为了更好适应生存环境进行主动性死亡的过程。其过程主要表现为：当受到不同内外环境刺激时，会引发不同途径介导的一系列凋亡起始，导致凋亡小体的形成，之后凋亡小体会激活相应的Caspases家族引发级联反应，最终导致凋亡的出现［25］。Li等在研究中将BMSCs中的线粒体直接或间接通过纳米管的方式移植到受损部位，实验表明，线粒体内化后改变了凋亡率和凋亡相关蛋白质运动神经元的表达，促进了神经元的生存；与SCI组相比，线粒体组大鼠BBB评分显著提高，促进了SCI大鼠运动功能的恢复，说明BMSCs的移植能够有效地促进凋亡的下降，损伤部位的恢复［26］。大量研究表明，当脊髓损伤发生后神经细胞的相继凋亡，其凋亡特征为主要分布在白质上，凋亡细胞以胶质细胞为主［27］。而胶质细胞具有连接神经递质、突触的桥梁作用，并且能够参与多种细胞、神经因子的修复、生长。大量研究表明，BMSCs移植能够提高神经元细胞向少突胶质细胞的分化水平，更好地调节胶质细胞与神经元之间的平衡，增加少突胶质细胞的成活率，从而抑制细胞凋亡［28］。

2.2 BMSCs神经再生机制

突触作为神经元胞体的延伸部分，对于神经系统的可塑性恢复具有重要意义，轴突作为其中的一种，主要作用就是将神经元胞体的兴奋冲动传递至其他神经元或效应器上。在一般情况下，当SCI发生后轴突不能再生，其部分原因是缺乏神经营养因子（NGF），包括由脑源性神经营养因子（BDNF）、NT-3和神经营养因子4/5（NT-4/5）组成的生长因子家族［29］。它们对神经的生存、发育、功能维持和中枢神经系统（CNS）的可塑性至关重要。即使轴突能够再生，它们也很少针对正确的突触后神经元或形成突触连接来恢复功能［30-34］。

研究证明BMSCs能够给细胞提供营养，通过提供生长因子支持神经干细胞的生长和分化。据报道，BMSCs能够很好地表达神经营养因子并且有良好的受体亲和力［35］，这在神经细胞的发育、再生和存活中非常重要。在较早的研究中，研究人员将BMSCs在含有胎儿牛血清中进行培养，发现未被治疗的细胞中BDNF、GDNF、NGF、NT3和NT4/5基因的表达也显著增加［36］。Min Ye等为了研究BMSCs分泌胶质细胞和衍生神经营养因子（GDNF）的能力，分别通过反转录酶聚合酶链反应和酶相关免疫素检测（ELISA）检测了BMSCs的GDNF和蛋白质表达。当BMSCs培养3 d时，检测到GDNF和蛋白质，当培养3、7、10 d后逐渐增加，说明了BMSCs具有明显的分泌GDNF的潜力［37］。大量研究表明，BMSCs分泌NTFs并促进神经修复、招募支持细胞或修复受损组织。BMSCs移植到受损的中枢神经系统后，能直接定居在损伤部位，取代失去的神经元，分泌生长因子，改善突触可塑性恢复，并提供促进细胞存活的微环境［35］。即通过BMSCs移植，能够使神经营养因子允许轴突延长并以正确的数量向适当的目标延伸，提高细胞存活率，最终对损伤部位的神经生长起到积极作用。

3 BMSCs与电针治疗SCI的联合作用

3.1 作用机制联合

BMSCs和电针在治疗脊髓损伤方面都表现出了极大的潜能，并且两者可以相互配合，共同作用在SCI受损部位。已有学者发现，BMSCs的增殖分化，可以加速诱导电针对SCI运动及感觉功能的改善，减少继发性疾病，从而加速损伤的恢复。有学者证实电针可以改善脊髓损伤部位的微环境，促进移植干细胞的迁移。Hui Jind等在体外培养干细胞的NT-3和TRKC基因的神经网络支架后，通过电针进行干预，发现因子的再生数量明显增高，并能维持原有的突触结构，建立新的突触状衍生神经元［38］。Ying Ding等将BMSCs移植和电针治疗相结合直接作用于受损大鼠部位发现，相比较其他组，本组的NT-3含量增加，BBB评分显著提高，肌纤维偶尔能进行主动性收缩。荧光免疫化学染色显示，移植的BMSCs能够分化成神经元状细胞或胶质状细胞，使细胞含量显著增加［39］。

电针能够刺激神经元的去极化，导致神经胶质细胞某些电压门离子通道开启，进而刺激细胞内CAMP水平升高和神经营养因子的自动释放，增加组织的CAMP水平和神经营养因子的表达，如NT-3、BDNF、NGF和GDNF。CAMP作为被第一个识别的第二信使，具有调节神经递质合成的作用，在对细胞外的反应中具有重要影响。CAMP水平的提高能够有效促进激素分泌，促进轴突生成，加速下游激活复合物的形成，推动细胞生长［40］。此外一些研究已经表明BMSCs能够分泌各种生长因子和细胞因子［36］，促进体内的轴突生长。同时，电针治疗可以抑制脊髓损伤后星形细胞的活性增殖，并防止形成胶质疤痕。因此，结合BMSCs移植和电针治疗可以相互配合改变病变部位的有害环境，通过增加神经营养因子和CAMP水平，抑制胶质疤痕的形成，促进轴突再生。

3.2 时间窗联合

对于时间窗的理解，目前主要有两种比较认可的说法。对于电针治疗SCI方面也有同样的两种相关理解。

一是开始介入治疗的时间切入点［41］。王婷婷等在造模成功的急性SCI大鼠，给予不同时间点开始进行治疗，研究结果发现，虽然电针组均优于对照组，但当造模成功2 h时就进行电针治疗效果最显著，SOD和一氧化氮（NO）含量明显提高，能够有效清除自由基，保护受损的脊髓组织［42］。高连军在不同时间点进行SCI治疗后通过磁共振成像进行有效对比后发现，在SCI后2～4 h进行电针治疗，纤维束修复程度明显改善［43］。二是介入治疗的有效疗程［44］。电针在对于治疗SCI疗程上的不同，也会产生不同治疗效果。有学者在不同时间段对损伤的大鼠进行电针治疗时发现，第3天开始，脑源性神经因子数量开始高于对照组，在2周时呈现到最高状态，第4周时，电针组与损伤组差别不大［45］。以上研究能够说明在SCI发生后，电针越早的介入，进行有效治疗，对于损伤后的治疗效果越明显［46］，但达到2～3周的治疗时间后，会达到峰值，继续进行电针治疗，虽有效果，但作用逐渐降低。但具体时间，尚有待研究。对于BMSCs治疗SCI也有相对显著的治疗时间窗。即当SCI发生后，不需要立即进行BMSCs的移植处理，在SCI损伤后期能够为移居的干细胞提供一个更加适合的环境，避免了移植排斥，病毒抗原的风险，让自体再生成为可能［47］。研究表明，在3 d时开始移植BMSCs使损伤部位的干细胞存活率提升，且迁移距离明显增强，能够有效抑制炎性因子的释放，重建受损的血脑屏障［48］。

因此，在SCI发生后，可以立刻进行电针治疗，清除自由基，使纤维素进行有效修复。在损伤发生3 d后，在进行电针治疗的同时，开始移植BMSCs，为干细胞营造一个适合的环境，促进神经因子的有效再生。当电针治疗进行到2～3周时，减少电针的治疗手段，配合其他康复疗法进行SCI后的修复。二者在时间窗上的联合应用，对于SCI后的恢复，能够达到显著的疗效。

4 总结与展望

SCI是一个十分复杂的病程，对于其损伤部位和继发性的发展有众多的不确定因素，各个通路、各个环节间层层影响。对于以往的研究大多都是电针对镇痛、炎症、神经细胞损伤等单一方面，并不能把每个环节、通路进行联系，其研究效果不明显。随着针灸技术、文化思想的不断深入发展，电针治疗SCI逐渐普遍应用于临床，其简便，疗效显著，无副作用等治疗优势也不断被展现，但是对于治疗机制尚研究不足。

近年来，间充质干细胞被作为“万能细胞”被广泛研究，尤其BMSCs具有分化增殖力强，适应度高等优点能与不同治疗手段相结合，应用在治疗众多疾病方面，这给电针治疗SCI提供了一个全新的思路。二者结合在促进神经营养因子、抑制细胞死亡、改善损伤部位炎症方面可以达到事半功倍的效果。但是在目前的研究中尚有几点局限性尚需解决。1）目前的研究中多集中在短期的实验效果方面，尤其电针的长期干预及其持久效果尚未可知。2）电针联合BMSCs的研究目前尚局限在相关蛋白方面，还不能从基因、代谢方面进行说明其相关影响。3）针对电针联合BMSCs，如何能从SCI众多的疾病影响环节中，找出相对长期、有效、与人体亲和度高的治疗方法仍是我们追寻的目标。