少花蒺藜草入侵对根际土壤磷细菌群落多样性的影响

高金会，王 然，宋 振，郓玲玲，付卫东，王忠辉，马 涛，王 伊，张国良

中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所，北京 100081

少花蒺藜草CenchrusspinifexCav.为禾本科Poaceae蒺藜草属Cenchrus一年生草本植物，原产北美洲及热带沿海地区(高晓萍和杨旋，2008)，我国于20世纪30年代首次发现，现主要分布在辽宁、内蒙古、吉林等省(自治区)(徐军，2011)。少花蒺藜草具有高抗逆性、高繁殖力、传播途径多样和高侵染力等特点，适应能力极强，可在短时间内形成单一优势群落，降低草场生物多样性，加剧土壤沙化；其刺苞表面密被许多小刺，会对人及牲畜造成伤害,影响农牧生产(杜广明等，1995；高晓萍和杨旋，2018)。

外来入侵植物定殖成功后，迅速形成单优群落，降低本地生态系统的群落多样性(Bajwaetal.,2016)。入侵植物与土壤微生物之间的互作在其定殖、扩散过程中发挥重要作用(Wardleetal.,2004)。研究表明，外来入侵植物能够改变入侵地有机质、氮磷钾等养分含量(薛敬意等，2002;Wangetal.,2018)，同时影响土壤的微生物群落组成(祁小旭等，2019；Battenetal.,2006),如糖蜜草MelinisminutifloraP.Beauv.(Ribeiroetal.,2017)、紫茎泽兰Ageratinaadenophora(Spreng.) R.M.King et H.Rob.(戴莲等，2012；于文清等，2014;Niuetal.,2007)、加拿大一枝黄花SolidagocanadensisL.(周振荣，2010；Wangetal.,2018)。研究表明，根际解钾菌数量较为丰富,且大多具有较高解钾活性，可能对其钾富集具有重要贡献(闫雅楠等，2019)。黄顶菊Flaveriabidentis(L.) Kuntze.入侵后土壤中有效磷的含量降低(Huangetal.,2015;Shaheen,2015)，并且可显著增加解磷细菌的数量(纪巧凤，2014)。rep-PCR结果显示，与万寿菊TageteserectaL.对比，黄顶菊显著增加了入侵地根际解有机磷细菌、解无机磷细菌的数量(宋振等，2016)。

少花蒺藜草具有化感作用，其根系及根际土壤水提液对马唐Digitariasanguinalis(L.) Scop.胚根生长均表现高浓度抑制、低浓度促进作用(王坤芳等，2017)，从而利于自身生长。目前,对少花蒺藜草入侵影响土壤养分的研究已有报道，如少花蒺藜草入侵可使土壤中的有机质及速效养分含量随着生长期的变化有不同程度的下降，与小叶杨PopulussimoniiCarr.和黄柳SalixgordejeviiY.L.Chang et Skv.相比，少花蒺藜草入侵降低了土壤有机质、速效磷含量(周立业等，2014)，但对少花蒺藜草对土壤磷元素高效吸收利用机制的研究尚未见报道。本研究采用高通量测序技术，分析了少花蒺藜草与冰草Agropyroncristatum(L.) Gaertn.、狗尾草Setariaviridis(L.) Beauv.根际土壤及空白对照土壤中解磷菌的组成差异以及与环境因子之间的关系，研究了少花蒺藜草入侵对根际土壤解磷菌的影响，以期为揭示其入侵机制提供理论依据。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验种子 少花蒺藜草种子于种子成熟期采于辽宁省彰武县阿尔乡白音花农场，冰草、狗尾草种子购于北京金土地农业技术研究所种子销售处。挑取健康饱满的种子，用2%NaClO溶液消毒10 min后，用蒸馏水反复冲洗至澄清，室内晾干，供后续试验使用。

1.1.2 试验用土 供试土壤取自少花蒺藜草的发生地辽宁省彰武县阿尔乡白音花农场，去除杂草等杂物，去除表层2 cm土层，采集2～10 cm土壤带回实验室，过2 mm筛，作为后期盆栽用土。

1.2 试验设置及采样

以上述土壤为基质，将种子播于花盆(花盆大小23 cm×18.4 cm)内，设置4个处理：分别种植少花蒺藜草、冰草、狗尾草和空白对照(裸土)，每个处理5个重复。出苗后间苗处理，每盆保留10株健康植株，其间保持培养条件一致，室内温度10～30 ℃，光照度10～25 klx，湿度30%～60%。培养50 d后采集土壤样本，去掉表层土壤(3 cm左右)，采用抖根法获得植物根际土壤样本。

1.3 土壤理化性质测定

参照鲍士旦(2000)测定土壤pH(电极法)、有机质(重铬酸钾容量法)、全氮(半微量开氏法)、全磷(碳酸氢钠钼蓝法)、全钾(火焰光度法)、速效磷(碳酸氢钠法)、速效钾(联合浸提-比色法)等理化指标。土壤磷酸酶活性测定采用磷酸苯二钠比色法测定(邢培茹，2014)。

1.4 高通量测序

1.4.1 土壤DNA的提取 采用土壤基因组DNA提取试剂盒(北京，Solarbio公司)提取土壤样品总基因组DNA，利用1%琼脂糖凝胶电泳及超微量紫外分光光度法检测DNA纯度。

1.4.2 PCR扩增 按指定测序区域，合成带有barcode的特异引物，或合成带有错位碱基的融合引物。采用TransGen AP221-02 PCR反应体系：TransStart Fastpfu DNA Polymerase 20 μL，DNA模板10 ng，上、下游引物(5 μmol·L-1)各0.4 μL，dNTP(2.5 mmol·L-1) 2 μL，FastPfu Polymerase 0.4 μL，5×FastPfu buffer 4 μL，补充ddH2O至20 μL。PCR扩增程序：95 ℃预变性 2 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30个循环；最后于72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。每个样品3个重复，将同一样品的PCR产物混合后用2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1.4.3 Miseq文库构建 连接“Y”字形接头；使用磁珠筛选去除接头自连片段；利用PCR扩增进行文库模板的富集；氢氧化钠变性，产生单链DNA片段。

1.4.4 Miseq上机测序 DNA片段的一端与引物碱基互补，固定在芯片上；另一端随机与附近的另外一个引物互补，也被固定住，形成“桥(bridge)”；PCR扩增，产生DNA簇；DNA扩增子线性化成为单链；加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP，每次循环只合成一个碱基；用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类；将“荧光基团”和“终止基团”化学切割，恢复3′端黏性，继续聚合第二个核苷酸；统计每轮收集到的荧光信号结果，获知模板DNA片段的序列。

1.5 数据分析

采用Excel 2010和SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。采用单因素(one-way ANOVA)和Duncan法进行方差分析和多重比较(α=0.05)。

Miseq测序得到的PE reads先根据overlap关系进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤。由于不同样本间的reads数不同，因此在分析多样性和群落组成前，先依据最低reads数进行标准化。区分样品后进行OTU (operational taxonomic unit)聚类分析和物种分类学分析，基于OTU进行物种多样性指数分析。基于分类学信息，在各个分类水平上进行群落结构的统计分析。在上述分析的基础上，进行一系列群落结构和系统发育等的统计学和可视化分析。使用FLASH v 1.2.7对下机数据进行拼接，得到OTUs数据(raw tags)，利用Trimmomatic (v 0.33)对Raw Tags质控过滤，得到clean tgs，进行数据分析。基于97%相似度，利用Qiime (version 1.8.0)在Silva数据库进行OTU物种分类学分析和聚类分析(uparse聚类法)。Chao 1指数为土壤细菌群落丰富度指标，用以估计群落中OTU数目，Chao1指数越小群落丰富度越高(Chao,1984)，Shannon指数为用来估算样品中细菌群落多样性指标，Shannon值越大群落多样性越高(Shannon,1948)。利用Qiime (version 1.8.0)对Chao1和Shannon指数进行分析Alpha多样性，用t检验分析Alpha多样性指数差异，然后用R作图；利用柱形图表示细菌群落组成；PCA分析 (principal component analysis)，即主成分分析，通过分析不同样本群落组成可以反映样本间的差异和距离，可以有效地找出数据中最“主要”的元素和结构，样本组成越相似，在PCA图中的距离越近；各样本差异物种组成通过one-way ANOVA单因素方差分析，先使用LEfSe软件non-parametric factorial Kruskal-Wallis (KW) sum-ranktest(非参数因子克鲁斯卡尔-沃利斯秩和验检)检测显著丰度差异特征，并找到与丰度有显著性差异的类群，然后采用线性判别分析(LDA)来估算每个组分(物种)丰度对差异效果影响的大小；通过RDA (redundancy analysis)分析，可以明确植物根际解磷细菌群落与环境因子之间的关系，利用Canoco软件作图。

2 结果与分析

2.1 根际土壤理化性质分析结果

试验土壤的基本理化性质:pH8.5、全氮含量0.016%、全磷含量0.002%、全钾含量2.52%、有机质含量5.4 g·kg-1、有效磷含量7.58 mg·kg-1、速效钾含量63.2 mg·kg-1。

各处理土壤理化性质指标如表1所示。结果显示，不同处理的土壤pH均呈碱性；3个种植植物处理的根际土壤有机质含量都显著高于空白对照，为15.60～20.3 g·kg-1，且少花蒺藜草处理显著低于狗尾草、冰草植物处理；不同处理的速效磷含量之间表现出了显著的统计学差异，从高到低依次为狗尾草>空白对照>冰草>少花蒺藜草，少花蒺藜草处理速效磷含量显著低于其他处理；各处理之间全磷含量的大小关系为冰草>狗尾草>少花蒺藜草>CK，少花蒺藜草处理与CK显著低于冰草与狗尾草处理，而少花蒺藜草与CK之间差异不显著。磷酸酶活性从高到低依次为少花蒺藜草>狗尾草>冰草>CK，少花蒺藜草处理显著高于其他处理。

表1 不同处理根际土壤理化性质Table 1 The physical and chemical properties of different treatment

2.2 根际土壤解磷菌OTU分类学分析结果

通过对20个样本高通量测序，经拼接和过滤处理后，以97%的序列相似性作为阈值进行OTU划分，共产生20499个根际土壤解磷菌OTU(图1)。其中4个处理中共有的解磷菌OTU为1519个，仅占所有总数的7.41%，不同处理之间解磷细菌存在较大差异。少花蒺藜草处理的解磷菌OTU总数最高，为9289个；CK次之，为9239个；冰草处理的OTU总数最低，为8621个。各处理中CK特有的解磷菌OTU最高，且显著高于种植植物的处理，为5819个；少花蒺藜草在种植植物处理中所特有的解磷菌OTU数目最高，为1919个。另外，在3个种植植物的处理中，少花蒺藜草与CK共有的解磷菌OTU数目最高，为2747个；狗尾草处理次之，为2319个；冰草处理数目最低，为2172个。

图1 细菌OTUs分布维恩图Fig.1 Venn graph of bacteria OTUs distributionCK：空白土壤；cp：少花蒺藜草；ac：冰草；sv：狗尾草。

2.3 根际土壤解磷菌Alpha多样性分析结果

2.3.1 Shannon多样性分析 由图2可知，CK的Shannon指数最高，少花蒺藜草处理在3个种植植物的处理中Shannon指数值最高，冰草处理次之，狗尾草处理最低。表明少花蒺藜草根际土壤解磷菌的群落多样性显著高于其他植物处理的根际土壤(P<0.05)。

2.3.2 Chao1指数 Chao1指数箱型图结果如图3所示，其趋势与Shannon指数值相似，CK的Chao1指数值最低，3种植物样本中少花蒺藜草处理的Chao1指数值最高，冰草处理次之，狗尾草处理指数值最低。表明在不同种植植物的处理中，少花蒺藜草处理的根际土壤具有最低的细菌群落多样性。

2.4 细菌群落组成分析结果

将样本结果与数据库进行对比分析，统计在各个分类水平下的解磷菌群落组成，others为占比较低、不足1%的物种，将未得到生物学注释的物种归为unidentified。

对4种处理的土壤样品序列进行分析，选取在门水平上丰度前5名的物种，绘制物种相对丰度柱形累积图。由图4可知，各土壤样品的细菌组成基本相似但比例有所不同，各处理中的优势菌门为变形菌门Proteobacteria、放线菌门Actinobacteria、厚壁菌门Firmicutes、浮霉菌门Planctomycetes，个别菌群所占的比例在不同处理之间有不同程度的差异。3种种植植物的处理中根际土壤变形菌门所占的比例明显高于CK，而少花蒺藜草处理的变形菌门所占比例在3个处理中最高；厚壁菌门和浮霉菌门在各样本中所占的比例未表现出明显变化。

图2 不同处理之间Shannon指数箱型图 图3 不同处理之间Chao1指数箱型图

图4 不同样本细菌在门分类水平的相对丰度Fig.4 Relative abundance of bacteria from different samples at phylum levelCK：空白土壤；cp：少花蒺藜草；ac：冰草；sv：狗尾草。CK:Soil without plants;cp:C. spinifex;ac:A. cristatum;sv:S. viridis.

2.5 不同处理物种组成相似性和样本聚类树分析结果

2.5.1 PCA分析 主成分分析(PCA)结果显示(图5)，种植植物的处理位于PC1正半轴，而CK位于PC1负半轴，说明种植植物处理给土壤微生物组成带来了较大变化；少花蒺藜草与狗尾草处理位于PC2的正半轴且距离非常接近，而冰草处理位于PC2的负半轴，说明少花蒺藜草与狗尾草处理微生物群落结构相似值最高，与冰草处理相似性较低。

2.5.2 UPGMA聚类树 基于Bray-Curtis算法，将20组样品做出相应的UPGMA聚类树，聚类树中的样品越靠近，其枝长越短，则说明2组样品之间的物种组成越相似。从图6可知，少花蒺藜草处理与狗尾草处理最为靠近且枝长较短，二者聚为一类，冰草次之，而CK位于另一个分枝且枝长较长，说明少花蒺藜草处理与狗尾草处理的根际土壤解磷菌组成具有较高的相似性，而冰草与这二者存在一定的相似性，CK与另外三者物种组成相似性最低，与主成分分析结果一致。

2.6 LEfSe多级物种差异判别分析结果

通过LEfSe分析(图7)，得到在少花蒺藜草处理中显著富集且与其他处理有显著性差异的5个解磷菌类群，进一步分析得到，它们分别是α-变形菌纲Alphaproteobacteria、海洋链霉菌Streptomyces_sp_ZFG47、链霉菌目Streptomycetales、链霉菌科Streptomycetaceae、链霉菌属Streptomyces。这说明α-变形菌、链霉菌在少花蒺藜草对于磷的吸收中可能起较为重要的作用。

图5 20个土壤样品微生物PCA分析 图6 基于Unweighted unifrac距离矩阵的UPGMA聚类树 Fig.5 PCA analysis of bacteria in 20 soil samples Fig.6 UPGMA based on Unweighted unifrac distance matrix

图7 LEfSe多级物种层级树图 Fig.7 LEfSe hierarchical tree of species

2.7 环境因子关联性分析结果

通过RDA分析明确植物根际解磷细菌群落与土壤因子之间的关系(图8)。放线菌门落在速效磷箭头的正方向上，说明土壤中速效磷含量越高，放线菌门的丰富度越高；浮霉菌门、蓝细菌Cyanobacteria落在速效磷箭头的反方向上，说明土壤中速效磷含量越高，2种细菌的丰富度越低；后壁菌门与速效磷几乎垂直，相关性较低。变形菌门落在全氮、全钾、有机质箭头的正方向上，说明土壤中全氮、全钾、有机质的含量越高，变形菌门的丰富度越高。

图8 土壤样品中门水平下的细菌丰度和土壤因子的冗余分析Fig.8 Redundancy analysis (RDA)of abundant bacteria phyla and soil properties of soil samples

由表2可以得出，第一排序轴揭示了各处理样本中63.5%的变异，第二排序轴揭示了样本中11.4%的变异，前2个排序轴一共解释了74.9%的样本总变异。第一排序轴与pH、有机质、全氮、全钾有较强的相关性(相关系数分别为0.7691、-0.8159、-0.8487、-0.8279)，第二轴与速效磷、速效钾有较强的相关性(相关系数分别为0.448、-0.5445)。

表2 冗余分析结果Table 2 Summary of the results of redundancy analysis

3 讨论

外来入侵植物定殖成功后，会在入侵地迅速形成单一优势群落，破坏当地生物群落结构，使本地物种生物多样性大大降低,并且影响入侵地的土壤理化性质和微生物群落结构与功能，使其更适合自己的生长发育而不利于本地植物的生长(Wangetal.,2018)。本试验中，少花蒺藜草根际土壤有效磷含量远低于空白对照土壤和本地植物(冰草、狗尾草)土壤，可能由于少花蒺藜草对磷的吸收能力强，导致土壤中磷含量过低，从而对周围植物的生长产生不利影响。刘红梅等(2012)研究发现，黄顶菊入侵后土壤中的速效磷含量低于本地对照植物处理，与本研究结果类似。而杨国庆等(2014)研究表明，入侵植物紫茎泽兰入侵地相比周围未入侵地的有效磷含量显著提高，这可能与不同入侵植物对磷的利用方式不同有关。

越来越多的研究表明，外来入侵植物对入侵地土壤微生物群落的改变是其能够成功入侵的重要原因之一(Bowenetal.,2017;Niuetal.,2007;Reinhart &Callaway,2006)。外来植物从原生地传播扩散到入侵地后，会进行大量的繁殖扩散，与本地植物竞争生存空间、水分光照等条件，入侵植物通过改变入侵地土壤理化性质与微生物的群落组成来影响抑制本地植物的生长与扩散，通过破坏本地植物与土壤微生物之间的相互关系，间接有利于自身群落的生长。在这个过程中，土壤微生物群起到了重要的“桥梁”作用(Battenetal.,2006;Kourtevetal.,2002;Lietal.,2006)。本研究中，根际土壤解磷菌OTU分类学及Alpha多样性分析结果表明，少花蒺藜草处理具有最高的OTU总数，所特有OTU在种植植物处理中的数量也最高；且在种植植物的各处理中，少花蒺藜草的Shannon指数、Chao1指数高于其他处理。这说明相比于其他植物，少花蒺藜草入侵后提高了根际土壤解磷菌群落丰富度，降低了根际解磷菌的群落多样性。

相比于空白对照处理，种植植物处理都使根际土壤解磷菌群落结构组成发生了不同程度的变化。PCA与UPGMA聚类结果表明，各处理之间少花蒺藜草处理与狗尾草处理具有最大的物种组成相似性。LEfSe分析发现，少花蒺藜草处理中显著富集且有显著性差异的5个解磷菌类群，其中α-变形菌与链霉菌(尤其是链霉菌)在少花蒺藜草入侵过程中可能起着较为重要的作用。有研究发现，外来植物薇甘菊MikaniamicranthaKunth和三叶鬼针草BidenspilosaL.入侵后，入侵地土壤微生物群落的优势菌群与α-变形菌纲具有很近的亲缘关系(陈亮等，2011)；入侵植物紫茎泽兰在红壤、黄壤和紫色土3种土壤条件下的根际微生物优势菌属都有链霉菌(刘海等，2018)。在放线菌中起解磷作用的主要是链霉菌(李阜棣和胡正嘉，2000)，Farhatetal.(2015)对链霉菌属细菌解磷机制研究表明，链霉菌属菌株主要的解磷机制是葡萄酸的分泌。环境因子关联分析结果显示,放线菌门与土壤中速效磷含量具有相关关系，变形菌门与土壤中全氮、全钾、有机质具有正相关关系。胡静(2015)也发现变形菌门和浮霉菌门与大针茅StipagrandisP.A.Smirn.根际土壤磷含量显著相关。植物根际微生物的群落结构除了受到土壤理化性质的影响，植物根系的分泌物，如有机酸、磷酸酶、化感物质等也会影响其群落的分布及结构；微生物群落反过来也会影响这些因素，二者是相辅相成的关系。所以少花蒺藜草根际解磷菌群落结构的独特性也说明了少花蒺藜草在根系分泌物方面可能存在其独特性。

4 结论

与对照植物相比，少花蒺藜草入侵显著降低了土壤速效磷和全磷含量，显著提高了土壤解磷菌的活性和土壤解磷菌的群落多样性。在各处理中种植少花蒺藜草的根际土壤具有最高的OTU总数，所特有OTU数在种植植物处理中的数量也最高；且在种植植物的各处理中，少花蒺藜草的Shannon指数、Chao1指数高于其他处理。

与空白对照相比，种植植物处理都使根际土壤解磷菌群落结构组成发生了不同程度的变化。PCA与UPGMA聚类结果表明，少花蒺藜草处理的根际土壤解磷菌与狗尾草处理具有最大物种组成相似性。LEfSe多级物种差异判别分析结果表明，少花蒺藜草处理中显著富集且与其他处理有显著性差异的解磷菌类群为α-变形菌、链霉菌，其在少花蒺藜草对于磷的吸收中可能起较为重要的作用。变形菌门、浮霉菌门和放线菌与少花蒺藜草根际土壤中的全磷含量呈显著正相关，放线菌与少花蒺藜草根际土速效磷含量有紧密联系。少花蒺藜草通过改变入侵地根际土壤的解磷菌群落结构间接影响根际土壤的磷素环境，从而利于自身的生长。