湖南省平江县水稻根结线虫病发生及危害评价

彭思源，吕 军，邱立新，李奔奔，李新文，叶 姗，丁 中*

1湖南农业大学植物保护学院，湖南 长沙410128；2湖南省平江县植保植检站，湖南 岳阳 414500；3湖南省植保植检站，湖南 长沙410006

水稻OryzasativaL．是世界上最重要的粮食作物之一，在我国粮食生产中占有极其重要的地位。据报道,危害水稻生产的植物寄生线虫主要有35个属300多种(Upadhyayetal.,2014)，其中拟禾本科根结线虫Meloidogynegraminicola(Golden and Birchfield)被认为是对水稻危害最大的线虫之一(Duttaetal.,2012)。该线虫于1965年在美国路易斯安那州的禾本科杂草及燕麦AvenasativaL.上被发现(Golden &Birchifield,1965)，主要分布于热带和亚热带地区，在旱稻、灌溉地水稻、低洼地水稻、深水稻、水稻苗床上均可侵染危害，发病症状主要为植株矮小稀疏、叶片黄化(Plowright &Bridge,1990;Soriano &Reversal,2003)，造成的产量损失可达11%～80% (de Waele &Elsen,2007)。该线虫原主要在海南、广东、广西等我国的南部沿海各省危害。近年来随着气候变化、水稻种植模式的转变以及跨区作业的大型联合收割机的远程传播，且生产上缺乏抗性品种以及高效、低毒的化学药剂的使用，该病害在湖南、江西、福建、江苏、湖北等我国南方水稻主产区发生面积和危害逐年增加(冯辉等,2017;Songetal.,2017;Wangetal.,2017)，严重威胁我国的粮食安全。

湖南是我国的水稻大省，稻谷面积和总产量均居全国前列。近年来，湖南衡阳、益阳、岳阳、常德、株洲和长沙等多地发现水稻根结线虫病且危害日益严重(姚思敏等，2018)。吕军等(2019)对岳阳平江县水稻根结线虫的发生及病原种类进行了初步调查和鉴定，发现平江23个乡镇中有5个乡镇发生了水稻根结线虫病，并通过rDNA-ITS扩增、测序和比对将其鉴定为拟禾本科根结线虫。但没有对其病原形态特征做观察鉴定，且在平江的详细分布、发生危害情况尚不清楚。为此，本研究于2020年4—6月进一步对水稻根结线虫在平江县各乡镇的发生危害、分布情况再次进行了调查与种类鉴定，并调查了感病稻田的栽培方式及土壤的土种、土质，以期为平江水稻根结线虫病的科学防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究地概况

平江是典型的山区农业大县，是国家级产粮基地县，位于湖南省东北部，地处汨水、罗水上游，汨罗江自东向西贯穿全境，境内河网密布。平江县地貌以山地和丘陵为主，平均海拔298 m。土壤类型以山地红壤和黄红壤为主。地势东南部和东北部高，西南部低。平江气候属典型的亚热带季风湿润区，多年平均降雨量为1575 mm，多年平均温度为18.98 ℃(徐志鹏等，2020)。

1.2 调查与样品采集

2020年4—6月，对湖南省岳阳市平江县各乡镇不同栽培模式下的水稻根结线虫发生情况、发生频率及危害程度进行田间调查，通过与当地农业局植保站技术人员交流、走访水稻种植户以及实地采样等方式，记载水稻种植时间、栽培规模以及根结线虫病发生历史情况等。调查了安定、龙门、上塔等共24个乡镇，每个乡镇随机选取1～3个地点进行采样，每个采样地采10块田，5点法取样，各点采集2丛水稻，将各个点的样品混合后一起装入塑料袋中，并记录采样地点、土质、土种、栽培方式、播期和GPS信息等。

洗净当天采集的水稻，检查具根结的水稻发病株数，统计田块病株率、各地病株率和各地病田率；按分级标准计算田块根结指数和各地根结指数。病情分级标准采用0～10级的分级标准(Sharma-poudyaletal.,2005)。0级:健康，无根结；1级:根结小且数量极少，不易观察；2级:根结小，根结数量稍多，易观察；3级:根结小，数量较多且盘绕，根系功能未受影响；4级:根结数量较多，有较大根结，大部分根系功能健康；5级:25%～49%的根系上有根结，小部分根系功能未受影响；6级:50%～74%的根系上有根结，根系正常功能受到影响；7级:75%以上根系有根结，失去根系功能；8级:无健康根系，植株仍存活；9级:整个根系出现腐烂，植株趋于死亡；10级:植株死亡。

田块病株率/%=(田块病株数/田块总株数)×100；

各地病株率/%=田块病株率总和/各地田块数；

各地病田率/%=(病田数/调查田块总数)×100；

田块根结指数=[∑(各级病株数×相应级数值)/(调查总株数×最高级代表值)]×100；

各地根结指数=当地各田块根结指数总和/当地田块数。

1.3 供试虫源与单卵囊扩繁

将平江15个乡镇的水稻病株带回实验室进行单卵囊扩繁。在体式显微镜下破开根结，收集卵囊，将单卵囊孵化的线虫接种到培养的水稻上，接种20 d后收集卵粒，30 ℃黑暗条件下孵化；反复接种以扩繁种群。

1.4 平江根结线虫的种类鉴定

1.4.1 分子鉴定 对平江县15个发生水稻根结线虫病乡镇的线虫分别进行分子鉴定，以南方根结线虫M.incongnita(Kofold &White) Chitwood作空白对照，单条线虫的DNA提取方法参照吴文涛等(2014)。rDNA ITS基因片段(369 bp)扩增鉴定引物Mg-F3 (5′-TTATCGCATCATTTTATTTG-3′)、Mg-R2 (5′-CGCTTTGTTAGAAAATGACCCT-3′)及程序参照Htayetal.(2016)。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像系统拍照。

1.4.2 形态学鉴定 将分离出来的2龄幼虫热杀死固定后，采用甘油-乙醇快速脱水法对线虫进行脱水，将脱水后的线虫挑入甘油滴中，用石蜡封片，制作成玻片。在光学显微镜下进行形态观察并拍照以进行形态学鉴定，并采用de Man公式对线虫进行测计。

1.5 数据统计方法

运用SPSS 20.0软件对所有数据进行统计分析，采用Duncan′s新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 平江水稻根结线虫病田间症状和线虫形态特征

调查发现，水稻直播或移栽后20 d左右，发病田块水稻呈区域黄化、稀疏状，发病水稻长势差，严重时黄化，纤弱矮小(图1A)，在田埂边的发生概率高于水田中部；受害水稻根系发育受阻，长有根结，幼根根结膨大后弯曲成棒状、钩状或纺锤状并伴有大量须根，老根变棕褐色易腐烂(图1B)。

图1 拟禾本科根结线虫危害症状Fig.1 Symptoms in M. graminicola in fested fieldsA:田间症状;B:根部根结。A:Field symptoms;B:Roots showing severe root galling.

2.1.1 形态特征分析 会阴花纹：椭圆形至近圆形，背弓高、近方形，未见侧线，线纹连续、细密、环绕会阴，尾尖明显，尾端及肛门附近有明显纹线，阴门区一般无线纹(图2A)。

2龄幼虫：蠕虫状，热杀死后虫体腹略弯或僵直，体长为442～504 μm (图2B)；头架较弱，口针纤细，基部球小，中食道球及瓣门明显(图2C)，椭圆形；食道腺覆盖肠腹面；尾部细、长，尾末端呈细棍棒状(图2D)。

雄虫：虫体蠕虫状(图2E)，头架中等发达，头冠低、圆，与虫体连接处缢缩不明显；口针基杆圆柱状，基部球卵圆形，前缘平或略后斜(图2F)；精巢长、单条(图2G)；交合刺发达，引带杆状；尾短、钝圆(图2H)。

雌虫：虫体梨形或圆形，有明显的细颈(图2I)，口针纤细(图2J)。

2龄线虫测量值和de Man参数值见表1，平江各地理群体测量值略有差异。其中长寿镇群体的平均体长最长，为504.2 μm，福寿山镇群体的平均体长最短，为442.6 μm；木金乡群体的体宽值最大，为23.0 μm，福寿山镇群体的体宽值最小，为16.9 μm。平江线虫体宽均较相似纬度的浙江富阳、福建政和的测量值偏大，平江各群体的尾长较富阳、政和的偏短(刘国坤等，2011;刘乐乐等，2018)。

2.1.2 分子生物学鉴定 对各地采集的样品利用rDNA ITS特异性引物进行分子鉴定。结果表明，从安定镇、龙门镇居、福寿山镇和加义镇等15个乡镇的样品中均扩增出369 bp的DNA片段(图3)。由此确定，平江县安定镇、龙门镇居、福寿山镇和加义镇15个乡镇的水稻根系上发现的根结线虫均属于拟禾本科根结线虫。

图2 拟禾本科根结线虫形态特征Fig.2 Morphological characters of M. graminicolaA:会阴花纹;B:2龄幼虫;C:2龄幼虫头部;D:2龄幼虫尾部;E:雄虫;F:雄虫头部;G:雄虫精巢;H:雄虫尾部;I:雌虫;J:雌虫头部；A～J比例尺：50、100、50、50、200、100、50、100、100、20 μm。A:Female perineal patterns ;B:Second-stage juvenile (J2);C:Head of J2;D:J2 tail region;E:Male;F Head of male;G:Male testis;H:Male tail region;I:Female;J:Head of female;A-J scale bar:50,100,50,50,200,100,50,100,100,20 μm.

表1 拟禾本科根结线虫平江分离群体2龄幼虫形态特征测计值Table 1 Morphological characters of second-stage juveniles of M. graminicola of Pingjiang isolates

图3 拟禾本根结线虫特异性ITS引物PCR扩增片段电泳检测结果Fig.3 PCR amplification patterns for 15 M. graminicola populations generated with the specific rDNA-ITS primersM:Marker;1～15:大洲、岑川、加义、龙门、三阳、向家、三市、伍市、梅仙、木金、福寿山、上塔、长寿、安定、虹桥;N：阴性对照。

2.2 平江县水稻根结线虫病的发生和分布

调查结果表明，安定镇、龙门镇等15个乡镇的田块中发现水稻根结线虫病，发生率达63%。不同乡镇的发生程度也存在差异，其中长寿、安定的病田率达100%，岑川、梅仙等地的病田率低于20%；同时长寿、安定的病株率分别为51%、55%；安定、福寿山和长寿等3地水稻的根结指数大于10，岑川镇水稻受害较轻，根结指数为0.4(表2)。

全县水稻根结线虫病的发生在地理分布上呈现东南重、西北中等、中部轻的趋势，南靠汨罗江两岸的稻田水稻根结线虫病发生较严重。

表2 平江县水稻根结线虫病的发生情况Table 2 Occurrence of the rice root-knot nematode in Pingjiang County

2.3 平江县不同生态条件水稻根结线虫病危害比较

比较平江县不同生态条件下水稻根结线虫病危害情况，发现直播、抛秧田平均根结指数值(7.0、7.8)显著高于手插和机插田块的根结指数(0.7、0.4) (P<0.05)；不同土种田块的病情指数差异不明显，河沙泥、红黄泥、麻沙泥和酸紫沙泥的水稻田的水稻根结线虫病病情指数分别为6.7、8.8、5.4、7.4；种植于砂壤、中壤和重壤水稻的病情指数(8.2、8.8、9.3)明显高于种植于黏土和轻壤水稻的病情指数(4.3、3.0)(表3)。

表3 水稻根结线虫病在不同稻田的发生情况Table 3 Occurrence of rice root-knot nematode in fields with different cultivation mode

3 讨论与结论

21世纪以来，随着农村劳动力的大量流失和劳动力成本的不断上涨，水稻种植方式发生转变，直播、抛秧等轻简化栽培措施逐渐取代移栽，种植面积逐年扩大(Farooqetal.,2011;Liuetal.,2015)。直播稻播种后一般不建立水层，且在水稻三叶期前保持田间土壤湿润，这种水分管理模式有利于拟禾本科根结线虫的发生和危害，并导致直播田根结线虫的群体数量高于移栽田(Protetal.,1994)。直播田根结线虫群体数量的常年积累，导致近些年来水稻根结线虫病在直播稻种植区频发(López-Fando &Bello,1995)。本研究发现，水稻根结线虫病在平江县的发现乡镇已由2018年的5个乡镇发展到15个，呈蔓延趋势。特别是平江县东部和南部靠近汨罗江沿岸的乡镇水稻根结线虫病发生严重，需对该病害引起足够重视。

线虫的口针、体长、尾长等是用于鉴定根结线虫种类的重要参数。但拟禾本科根结线虫不同地理群体的体长、口针长度等参数变异较大。本检测结果表明，福寿山镇山区群体的体长、体宽、尾长等值较其他乡(镇)群体的值偏小，与Bellafiore &Brigcs (2010)结果相似，反映了不同地理群体存在一定的形态差异(Pokhareletal.,2010)，也表明了环境气候条件及寄主可能是影响线虫形态特征的重要因素(Jepson,1983)。

根结线虫病作为一种土传病害，土壤的质地、温度、pH值、氧化还原状态和水分含量均能影响水稻根结线虫病的发生(Sorianoetal.,2000;Winetal.,2011,2013)。调查发现，安定、长寿等水稻根结线虫病严重发生地多为砂壤、中壤或重壤，且不保水，有利于水稻根结线虫病发生(Bridgeetal.,2005)，而伍市镇等地稻田土质为黏土，保水性能较好，不利于线虫的侵染和繁殖(Griffin &Darling,1964)，发病较轻。调查中还发现，水稻根结线虫病在当地的早、中稻上发生较严重，晚稻上发生较轻，这可能与湖南6—8月份30 ℃以上高温不利于根结线虫卵的孵化(Rao &Israel,1973;Raoetal.,1971)及夏季翻晒降低了根结线虫群体数量有关(Khan &Singh,2008;Singhetal.,2005)。