铀污染水体中耐性微生物的鉴定及其研究

2022-12-13王笠成伍世杰胡雨婷曹艺川

中国新技术新产品 2022年18期

王笠成伍世杰胡雨婷曹艺川程馨

（成都理工大学生态环境学院，四川成都 610059）

铀是现代核工业过程中所需要的重要原料，由于其是一种具有化学毒性和放射性的核素[1]，如果不进行治理将引起一系列环境问题[2]，相关生物也会受到其放射性照射的危害。铀在水环境中的价态主要是U（IV）和U（VI），U（VI）溶解性较好，易造成严重的水体污染[3]。

利用微生物对重金属污染水体处理具有高效性、高性价比、低二次影响等优点，主要通过微生物对水体中铀的吸附作用，发生生物还原、矿化等反应，改变其物化性质，并降低迁移率。该方法关键在于耐性微生物筛选，培养驯化环境适应能力、耐受性、修复效率高的菌种是微生物处理技术研究的重点。Chen等[4]选用硫酸盐还原菌作为处理铀污染的微生物，研究发现该种微生物还原铀时不仅还原率高的同时自身生长会更好。

因此，该研究选用某铀水冶厂区附近的受污染河流为研究对象，从中筛选、分离出具有高耐受铀的菌株，并对其生物学特性及其分子生物学鉴定种类进行研究，以期望获得耐性微生物，为微生物在水体铀污染治理中的研究和应用提供资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 筛菌水样及试剂

筛选耐铀微生物的水样来自宜宾市某铀水冶厂附近的金沙江河段。在研究区布置5个点，每个点采集两个平行样，放入已经灭菌的250mL蓝口玻璃瓶中，同时放入冰袋保持低温。带回实验室后，放置于冰箱中于4℃保存，并在2d内进行优势细菌的培养、分离、纯化。牛肉膏、蛋白胨、Nacl、琼脂粉菌均购于成都科隆化学品有限公司；硝酸铀酰购于西安鼎天化工有限公司，纯度为分析纯及以上。试验用水均为超纯水。

1.1.2 培养基配置

NB培养基：按0.3g、1g、0.5g、100mL分别称取牛肉膏、蛋白胨、Nacl、超纯水于250mL锥形瓶中，121℃、0.1MPa下灭菌23min，冷却后备用。

固体培养基：按0.5g、1g、0.5g、2g、100mL分别称取牛肉膏、蛋白胨、Nacl、琼脂粉、超纯水于250mL锥形瓶中，121℃、0.1MPa下灭菌23min。稍冷却后导入平板中待完全凝固，备用。

1.2 耐铀菌株的筛选及鉴定

1.2.1 耐铀菌株的筛选

按比例配置150mLNB培养基充分冷却后加入0.5mL含铀废水，置于20℃下150r/min振荡培养48h。再取0.5mL菌液，加入含60mg/L、70 mg/L、80 mg/L、90mg/L的UO2+的NB培养基中置于20℃下150r/min 振荡培养48h。利用接种环蘸取生长状况较好、色泽较为单一的菌液，采用平板划线法进行纯化培养，直到培养基上重复出现单个菌落为止。

1.2.2 耐铀菌株的形态特征观察及初步鉴定

对筛选出的耐性菌株进行菌落形态观察，观察菌落表面、边缘、颜色等生物学特征。同时采用革兰氏染色法对优势细菌进行初步鉴定。

1.2.3 耐铀菌株的分子生物鉴定

该研究采用16S rDNA基因测序法，委托北京擎科生物科技有限公司成都分公司进行序列测定。

1.3 优势细菌特性研究

1.3.1 优势细菌生长曲线测定

接种一环细菌至150mLNB培养基中，活化18h～24h，再以0.5%（体积比）接种量接种到新鲜的NB培养基中，30℃，150r/min振荡培养，测定不同时间点溶液的OD600值，以时间为横轴、OD600值为纵轴绘制细菌的生长曲线。

1.3.2 耐性菌株生长条件影响试验

pH对耐性菌株的生长影响试验：将驯化后的菌株保持接种量一致，接入已经灭菌的NB培养基，调节培养基pH分别为5、6、7、8这4个梯度，在150r/min、30℃下每个pH进行3组平行试验，分别在不同时间点测度OD600值观察细菌生长情况。

不同接种量对耐性菌株的生长影响试验：将驯化后的菌株接种一环细菌至液体培养基中，活化18h～24h，再分别以0.25%、0.5%、1%、2%接种至已灭菌的NB培养基，调节pH一致，在150r/min、30℃下每个pH进行3组平行试验，分别在不同时间点测度OD600值观察细菌生长情况。

1.4 数据处理

对1.3中不同试验中的菌液，如果所测得结果过高，应稀释至0.1～0.9[5]，然后建立相关稀释倍数间的OD600回归方程。设菌株培养液不同稀释倍数间的OD600值回归方程为y=ax+b（x为相同培养时间培养液稀释后的OD600值，y为相同培养时间培养液稀释前的OD600值），通过解得a、b值后得到不同稀释倍数间的OD600值回归方程。然后将相应的OD600值带入相关回归方程后得到同一稀释倍数水平上的回归后所有OD600值。

2 结果与分析

2.1 菌株的初步鉴定

2.1.1 菌株的形态学特征

观察上述划线纯化得到的菌落的形态特征如图1所示，来进行初步鉴定。菌落形状不规则，大多成圆形，稍有光泽呈白色，在菌落周围有白色透明圈。

图1 划线纯化得到的菌株

镜检观察得出菌体细胞杆状，两端钝圆，无荚膜，多呈单个或链状排列的革兰氏阳性菌[6]，如图2所示。

图2 革兰氏染色镜检图

2.1.2 耐性菌株的基因组电泳图谱

将对耐铀菌株进行送样鉴定后，其基因组电泳图如图3所示，可以看出提取的菌株DNA条带清晰而明亮，说明成功提取到耐铀菌株的DNA，其序列大小在1500bp左右（注：marker从上至下依次为5000bp，3000bp，2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp）[7]。

图3 基因组电泳图

2.1.3 基因序列、构建系统发育树和种属分析

用ContigExpress拼接测序结果，并去除两端不准的部分。将拼接好的序列在NCBI数据库（blast.ncbi.nlm.nih.gov）中进行比对。

16S测序结果NCBI比对结果发现，该研究中的耐铀菌株的16S序列比对结果为Bacillus cereus（或同属），与Bacillus cereus的16S rDNA序列一致性为97%以上。

2.2 菌株生长影响试验

2.2.1 菌株生长曲线

通过分光光度法测定细菌不同生长时间培养液的OD600值，测得数据见表1，绘制菌株的生长曲线如图4所示。

表1 菌株不同生长时间培养液的OD600值

细菌在适宜的条件下培养经历4个阶段：延滞期、对数期、稳定期以及衰亡期。生长曲线反映了细菌在培养中所表现出来的生长和繁殖的规律。

由图4可以看出，0 h～6 h时间段内，OD600值很小且没有太大变化，细菌生长缓慢，属于延滞期；6 h后开始迅速生长，6h～31h为对数生长期，此时细菌得到丰富的营养，细胞代谢活力最强，合成新细胞物质的速率最快，细菌生长旺盛；在31h处进入稳定期，31h～48h为稳定期，此时溶液中的营养物质已被大量消耗，细菌生长比较稳定，但还是有所增长；48h后OD600值开始下降，菌株生长进入衰亡期。表明此时营养物质已被耗尽，且积累的有毒的代谢产物抑制细菌生长繁殖，死亡率增加。

图4 细菌生长曲线

2.2.2 不同添加量对菌种影响试验

将不同生长时间培养液按1.4中方法进行试验并处理数据[8-9]，其结果见表2。

将表2中数据代入y=ax+b可得培养液相应稀释倍数间的OD600值回归方程。由表3可知，随着菌体生长时间的增加，菌体培养液分别被稀释2倍、5倍、10倍时，每个稀释倍数由低到高的OD600值回归方程分别为y=1.8754x-0.3651y=1.0525x+0.4341、y=1.1668x+0.1498。

表2 添加量为0.25%时菌液不同稀释倍下OD600值

表3 细菌不同稀释倍数间的OD600值回归方程

根据测定环境因子对菌株生长的影响试验设计，测定添加量对菌株生长的影响，将添加量设置为0.25%、0.5%、1%、2%这4个梯度，分别对其进行培养并稀释再测定OD600。用回归方程（表3）计算出同一稀释倍数所表现的OD600值，结果见表4。

表4 不同添加量下培养液OD600测定值及回归值

添加量的大小决定细菌生长繁殖的速度，适当的细菌添加量可以缩短细菌繁殖达到高峰的时间，并可减少杂菌生长的机会。如图5所示，添加量为1%时细菌生长最好、繁殖最快，0.25%时其次，添加量为0.5%和2%时差别不大，细菌能正常生长但生长状况均差于添加量为1%、0.25%的条件。由此可见并不是接种量越大越好，接种量越大，工业成本越高，同时随着细菌的加入，其代谢产物也越多，对细菌的抑制和毒害作用也就越强[10]。

图5 不同添加量下菌株生长曲线

2.2.3 不同pH对菌种影响试验

根据测定环境因子对菌株生长的影响试验设计，测定初始pH对菌株生长的影响，将pH设置为5、6、7、8这4个梯度，分别对其进行培养并测定OD600。数据处理方法与1.4一致，结果见表5。

表5 不同pH下培养液的OD600测定值及回归值

从图6中可以看出，pH为5时，细菌生长受到抑制，适应期延后，整体生长情况不佳。当pH值为3～5时，U主要以UO22+的形式存在，此时毒性最强[11]。当pH为6时，前期增长较快，但从6h就有所下降，生长情况不稳定。可能是因为当pH=6.0时，铀主要以UO22+、UO2OH+、（UO2）3（OH）5+两种阳离子形态存在[12]。当pH为7和8时，细菌生长情况良好，当pH大于7时，铀的化学形态主要为碳酸铀酰配合物，同时少量的铀会形成铀酰氢氧化物沉淀物质。此时，溶液的毒性降低，减小对细菌生长的抑制。