紫外分光光度法测定腊肠中亚硝酸钠的不确定度评定分析

何明基 米浩

（钦州市灵山县产品质量检验中心，广西灵山 535400）

亚硝酸钠俗称亚硝酸盐，是由亚硝酸根离子与钠离子组成的无机盐，亚硝酸钠被广泛用于腌腊肉制品，具有防腐发色的功能，能够有效抑制肉毒素形成，维持食物的颜色鲜艳。亚硝酸钠是食品检测的常检项目，按GB 2760—2014 食品添加剂使用标准规定，肉制品中亚硝酸钠含量不得超过0.15 g/kg。食品检测结果实质上是对其真实值的估计，即使每一次完美的检测其结果都存在一定的可疑性。所以为了保障食品中亚硝酸钠检测结果的可靠性，采用不确定度进一步分析检测数值的离散程度，使其检测结果更具有说服力。目前关于腊肠中亚硝酸钠的不确定度评定分析报道比较少。因此本文采用GB 5009.33—2016《食品全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中第二法分光光度法，拟通过优化标准溶液范围，在计算模型中引入标准空白完善误差来源，评定腊肠中亚硝酸钠的不确定度，提高检测结果的可信度。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

腊肠，市购。

亚硝酸钠标准溶液，质量浓度200 mg/L，编号20013-200-W-20。

1.2 仪器设备

UV-2600 双光束紫外可见分光光度计；BSA224S电子分析，赛多利斯公司；移液管。

1.3 试验方法

称取2.53 g 粉碎均匀的腊肠试样置于250 mL具塞锥形瓶中，加12.5 mL 饱和硼砂溶液，加入150 mL 70 ℃水，混匀，于沸水浴中加热15 min，快速冷却至室温。定量转移至250 mL 容量瓶中，加入5 mL 106 g/L 亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入5 mL 220 g/L 乙酸锌溶液。加水至刻度，摇匀，放置30 min，过滤，弃去初滤液30 mL，滤液备用。

吸取2.50 mL 亚硝酸钠标准溶液，置于100 mL容量瓶，稀释得5.0μg/mL标准使用液。用移液管吸取40.0 mL上述样品滤液于50 mL具塞比色管中，另用1 mL移液管取0.00 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.50 mL、0.60 mL、0.70 mL（相当于0.0μg、1.0μg、2.0μg、2.5μg、3.0μg、3.5μg亚硝酸钠）亚硝酸钠标准使用液，分别置于50 mL 具塞比色管中。往标准管和试样管中加入2 mL 4g/L对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3 min 后各加入1 mL 2g/L 盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，静置15 min，用1 cm 比色杯，以零管调节零点，在波长538 nm处测吸光度，直接用分光光度计绘制标准曲线。同时做试剂空白。

2 结果与分析

2.1 数学模型

样品中亚硝酸钠含量（以亚硝酸钠计）按下式计算：

式中：x——试样中的亚硝酸钠含量，mg/kg；

ρ样——试样溶液中亚硝酸钠含量，μg；

ρ空——空白溶液中亚硝酸钠含量，μg；

V0——试样处理总体积，mL；

m样——试样质量，g；

V1——测定样液体积，mL。

2.2 分析测量不确定度分量来源

（1）标准溶液亚硝酸钠引入的标准不确定度，包括标准溶液稀释引入的标准不确定度以及线性拟合试样和空白(ρ样-ρ空)引入的标准不确定度。

（2）取试样体积V0引入的标准不确定度。

（3）称取试样质量m样引入的标准不确定度。

（4）取测定溶液体积V1引入的标准不确定度。

（5）试验重复性引入的标准不确定度。

（6）紫外分光光度计引入的标准不确定度。

2.3 评定不确定度分量

2.3.1 标准溶液的相对标准不确定度

（1）根据标准证书上亚硝酸钠标准液的相对扩展不确定度为2%，置信因子k=2，计算亚硝酸标准液相对标准不确定度ur(c标1)=2%/2=1.0×10-2。

依据JJG 196—2006《常用玻璃量器检定规程》，配制亚硝酸钠标准使用液时5 mL 吸量管和100 mL容量瓶引入的相对标准不确定度分别为0.005 811和0.000 858 0。

根据GB/T 601—2016《化学试剂标准滴定溶液的制备》附录A，试验温度为12 ℃，亚硝酸钠标准溶液的体积补正值单位是+1.10 mL/L。亚硝酸钠标准溶液稀释成亚硝酸钠标准使用液引入的相对标准不确定度为：

（2）依据标准系列溶液测试结果，采用测试仪器线性拟合，拟合方程为：A标=B斜ρ标+B截=0.015 294 1ρ标-8.823 5×10-5，相关系数是0.999 36。本试验取10份腊肠样品质量均约为2.53 g，吸光度分别为：0.029、0.029、0.030、0.029、0.029、0.030、0.030、0.030、0.029、0.030，相对应试样亚硝酸钠含 量ρ样分别为：1.902μg、1.902μg、1.967μg、1.902μg、1.902μg、1.967μg、1.967μg、1.967μg、1.902μg、1.967μg。试剂空白吸光度为0.005，亚硝酸钠含量为0.333μg。标准曲线吸光度和计算结算结果见表1。

表1 标准曲线吸光度和计算结果

参照JJF 1135—2005《化学分析测量不确定度评定》中式（14）及式（15），计算

式中：u(ρ样)——腊肠试样中亚硝酸钠含量标准不确定，μg；

u(ρ空)——空白试样中亚硝酸钠含量标准不确定，μg；

SR——校正标准曲线的残差标准偏差；

B斜——标准标准曲线斜率；

n标——标准工作溶液总共测量次数，本试验n标=6；

n样——样品溶液测量次数，本试验n样=10；

n空——空白样品溶液测量次数，本试验n空=1。

由于ρ样和ρ空在曲线上相距较远，忽略其相关性。则由绘制标准曲线引入的相对标准不确定度为：

最终由标准溶液引起的一系列相对标准不确定度为：

2.3.2 试样体积V0的相对标准不确定度

查JIF 196—2006 《常用玻璃仪器》 可知，250 mL 容量瓶（A 级）容量允许误差为±0.15 mL，认为服从均匀分布，则：

根据GB/T 601—2016《化学试剂标准滴定溶液的制备》附录A，试验温度为12 ℃，试样溶液体积补正值是+1.10 mL/L。

因此试样体积V0的相对标准不确定度：

2.3.3 试样质量m样的相对标准不确定度

本次试验试样称量值约为2.53 g，已知天平在0 g～50 g 称量范围最大允许误差MPEV=±0.000 5 g，认为服从均匀分布。

查看天平校准证书天平重复性是0.000 4 g，认为服从均匀分布。

因此试样质量m样的相对标准不确定度：

2.3.4 测定溶液体积V1的相对标准不确定度

根据JIF 196—2006《常用玻璃仪器》，20 mL吸量管（A）允许误差为±0.030 mL，认为服从均匀分布，则：

根据GB/T 601-2016《化学试剂标准滴定溶液的制备》附录A，试验温度为12 ℃，测定溶液体积补正值是+1.10 mL/L。

因此测定溶液体积V1的相对标准不确定度为：

2.3.5 试验重复性引入的相对标准不确定度

对10份腊肠中亚硝酸钠含量重复性测量，数据见表2，采用A类评定。

表2 10份腊肠样品中亚硝酸钠含量重复测量数据

因此试验重复性引入的相对标准偏差为：

2.3.6 紫外分光光度计引入的相对标准不确定度

因为已经过多次测试，认为仪器引入的不确定度已包含于测量结果中，不再另行评定，防止重复计算。

2.4 评定合成相对标准不确定度

所有误差来源的标准合成不确定度计算如下式：

2.5 评定合成标准确定度和扩展不确定度

合成标准不确定度uc=ur×=0.054 62×3.949=0.215 7 mg/kg，一般包含因子取k=2，置信度是95%，扩展不确定度U=2uc=2×0.215 7=0.44 mg/kg。

3 结论

通过计算发现，影响检测结果离散程度的主要因素是标准溶液，其次是试验重复性。因此，在检测腊肠中亚硝酸钠时，亚硝酸钠系列标准工作溶液质量浓度不宜过大，应尽可能使试样检测结果接近系列标准工作溶液质量浓度的平均值，有利于减小标准曲线的残差和试样的标准不确定度；化验员要认真负责，态度端正，规范操作水平，应尽可能使试验重复性一致，避免离群值出现。