具有酪氨酸酶抑制作用的豌豆多肽酶解工艺研究

徐梅 赵大洲 王常青 曹秀娟

1（厦门元之道生物科技有限公司，福建厦门 361100）

2（山西大学，山西太原 030006）

人体皮肤颜色主要取决于黑色素的分布及含量，而黑色素的形成受到机体内酪氨酸酶的控制，该酶的活性与含量影响皮肤黑色素的生成和颜色，同时也对皮肤有一定的保护作用。如果酪氨酸酶活性过高，会使皮肤颜色变深，从而影响美观，长久还可能产生老年斑和黄褐斑，因此，通过抑制酪氨酸酶活性达到皮肤美白效果的研究成为当前皮肤美容的热点之一。近十多年来，天然蛋白水解多肽的美容作用越来越受到人们的重视，如胶原多肽、酵母多肽、沙棘多肽与核桃肽等。本文研究了不同蛋白酶水解豌豆蛋白产生的多肽水解物对酪氨酸酶抑制率的影响，并筛选确定了抑制活性和多肽得率都较高的豌豆蛋白酶解工艺，为功能性豌豆多肽的加工奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

豌豆分离蛋白，山东金都塔林食品有限公司；酸性蛋白酶、枯草杆菌中性蛋白酶，广西庞博生物科技有限公司；Neutrase0.8 L 中性蛋白酶，诺维信酶制剂中国有限公司；ProteAX 中性蛋白酶、NY50中性蛋白酶和2SD 中性蛋白酶，阿玛诺天野酶制剂有限公司；酪氨酸酶，Sigma 公司；其他试剂均为分析纯。

UV-2600 紫外可见分光光度计，尤尼柯（上海）有限公司；高速离心机，湖南湘仪离心机仪器有限公司；超滤-纳滤膜组件，中科瑞阳膜技术（北京）有限公司；真空浓缩器，上海华良科学仪器厂；全自动定氮仪，上海宝英光电科技有限公司；L-3 凝胶色谱仪，上海金达仪器有限公司；其他均为常规仪器。

1.2 试验方法

1.2.1 酸性蛋白酶水解豌豆蛋白的工艺研究

豌豆蛋白粉与纯水按1∶20混合浸泡过夜，用酸调pH 值至3.0，再按原料蛋白质量加入酸性蛋白酶进行第一次水解，确定蛋白酶水解豌豆多肽的最适工艺。

1.2.1.1 酶解温度单因素试验

在加酶量5 000 U/g，水解时间2 h 条件下，分别在30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃温度下水解豌豆蛋白，所得水解液经加热灭酶和离心后，取上清液测定多肽含量和得率；调整多肽含量为15 mg/mL，测定并计算酪氨酸酶抑制率。

1.2.1.2 酶解时间单因素试验

在酶解温度50 ℃，加酶量5 000 U/g 的条件下，分别水解豌豆蛋白30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min、210 min，所得水解液经灭酶和离心后，取上清液测定多肽含量和得率；调整多肽含量为15 mg/mL，测定并计算酪氨酸酶抑制率。

1.2.1.3 加酶量单因素试验

分别添加酸性蛋白酶2 000 U/g、3 000 U/g、4 000 U/g、5 000 U/g、6 000 U/g、7 000 U/g，在50 ℃水解豌豆蛋白2 h，所得水解液经灭酶和离心后，取上清液测定多肽含量和得率；调整多肽含量15 mg/mL，测定并计算酪氨酸酶抑制率。

1.2.2 不同中性蛋白酶二次水解豌豆多肽的研究

由于酸性蛋白酶一次水解的多肽得率较低，为了提高多肽得率，需进行二次水解，考察不同中性蛋白酶的水解效果。取5 份等质量的酸性蛋白酶水解灭酶液（多肽得率和酪氨酸酶抑制率为21.70%和48.61%），分别加入枯草杆菌中性蛋白酶、ProteAX蛋白酶、NY50 蛋白酶、2SD 蛋白酶和Neutrase0.8 L蛋白酶，加酶量为5 000 U/g，调节水解液pH值7.0，50 ℃水解60 min，取样、灭酶、离心后，检测并计算多肽得率和酪氨酸酶抑制率。继续水解至120 min，将二次酶水解液加热灭酶，离心去除沉淀，检测并计算多肽得率和酪氨酸酶抑制率，确定水解效果最佳的中性蛋白酶。

1.2.3 抑制酪氨酸酶活性多肽分子段的筛选

将采用最佳中性蛋白酶二次水解得到的离心上清液分别用截留分子量为10 kDa、4 kDa、2 kDa 和1 kDa的超滤膜和300 Da的纳滤膜分离，得到5个分子量组分4 kDa～10 kDa、2 kDa～4 kDa、1 kDa～2 kDa、300 Da～4 kDa、＜1 kDa。将5 段多肽分离液多肽含量调整到15 mg/mL，测定各样品的酪氨酸酶抑制率和肽段占比，确定最佳活性分子段。

1.2.4 豌豆多肽质量浓度与抑制酪氨酸酶活性关系的研究

将300 Da～4 kDa的多肽滤液浓缩后，分别配制成多肽含量5 mg/mL、10 mg/mL、15 mg/mL、20 mg/mL、25 mg/mL、30 mg/mL、40 mg/mL 的溶液，测定不同多肽质量浓度的酪氨酸酶抑制率。

1.2.5 粗蛋白测定方法

按GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》规定的方法测定。

1.2.6 多肽含量测定方法

按GB/T 22492—2008《大豆肽粉》中附录B 的方法测定。

1.2.7 多肽得率计算方法

计算公式为Q=（S×T×100%）/W，

式中：S—水解液（离心或超滤）中多肽含量，g/mL；

T—水解液体积，mL；

W—水解原料液中粗蛋白质量，g。

1.2.8 酪氨酸酶活抑制率的测定与计算

以0.5 mmol/L L-多巴（左旋多巴）溶液为底物，以曲酸为对照品，按表1 进行试验，混匀后在37 ℃水浴保温10 min，检测波长475 nm。A（抑制率）=［1-（A1-A2）/（A3-A4）］×100。

表1 酪氨酸酶抑制率试验

2 结果与分析

2.1 酸性蛋白酶水解豌豆蛋白最佳工艺的确定

2.1.1 酶解温度对豌豆蛋白水解效果的影响

酶解温度对豌豆多肽得率和酪氨酸酶抑制率的影响如图1所示。

图1 不同酥解温度的多肽得率与酪氨酸酶抑制率

由图1可知，酶解温度低于60 ℃时对酪氨酸酶抑制率没有明显影响。酶解温度在50 ℃时，多肽得率最高，高于60 ℃时多肽得率快速下降，低于40 ℃时多肽得率较低，可能是温度过高时造成酶变性，温度过低时蛋白酶活力下降。因此，选择适宜的酶解温度为40 ℃～60 ℃。

2.1.2 酶解时间对豌豆蛋白水解效果的影响

酶解时间对豌豆多肽得率和酪氨酸酶抑制率的影响如图2 所示。

图2 不同水解时间的多肽得率与酪氨酸酶抑制率

由图2 可知，当酶解时间为30 min～150 min，所得水解液对酪氨酸酶抑制率稳定，无明显变化，超过150 min 水解酪氨酸酶抑制率呈下降趋势，可能是随着反应时间的延长，酪蛋白酶抑制多肽的干扰物质增多所致。多肽得率在酶解90 min～120 min时较高。综合考虑酪蛋白酶抑制率和多肽得率两方面要求，酶解时间控制在90 min～120 min较为适宜。

2.1.3 加酶量对豌豆蛋白水解效果的影响

加酶量对豌豆多肽得率和酪氨酸酶抑制率的影响如图3所示。

图3 不同加酶量水解的多肽得率与酪氨酸酶抑制率

由图3 可知，加酶量在3 000 U/g～6 000 U/g 范围时，多肽的酪氨酸酶抑制率较稳定，无明显变化；加酶量低于3 000 U/g或高于6 000 U/g时酪氨酸酶抑制率呈下降趋势，原因尚不清楚。多肽得率在加酶量5 000 U/g～6 000 U/g时较高。

2.2 中性蛋白酶二次水解豌豆多肽效果分析

不同中性蛋白酶二次水解效果见下页表2。由表2数据分析可知，先用酸性蛋白酶水解豌豆蛋白，再用NY50C中性蛋白酶二次酶解，酶解60 min时的酪氨酸酶抑制率和多肽得率比仅用酸性蛋白酶水解增高了58.67%和103.96%，经济可行性和性价比明显提高。用AX中性蛋白酶、0.8L中性蛋白酶和2SD中性蛋白酶二次水解豌豆多肽液均丧失了酪氨酸酶抑制活性，且多肽得率均明显低于NY50C中性蛋白酶。枯草杆菌中性蛋白酶二次水解多肽2 h 后，尽管多肽得率与NY50C中性蛋白酶相近，但是酪氨酸酶抑制率大幅下降，相比NY50C中性蛋白酶二次水解下降65.13%。因此，酸性蛋白酶解后，再用NY50C 中性蛋白酶二次酶解豌豆蛋白和多肽，多肽得率和酪氨酸酶抑制率分别达到47.90%和77.58%，此条件为最佳工艺组合。

表2 不同中性蛋白酶二次水解液的工艺参数比较

2.3 活性多肽分子段筛选结果

将经过膜分离的多肽液中多肽含量调整到15 mg/mL，分别测定各分子段多肽液的酪氨酸酶抑制率，然后用凝胶层析分析各分子段溶液中多肽含量与总多肽含量的百分比，结果见表3。由表3 可知，1 kDa～2 kDa 多肽的酪氨酸酶抑制率最佳，达到74.8%，2 kDa～4 kDa 和＜1 kDa 的多肽均有一定的抑制活性；而300 Da～4 kDa 分子段多肽占总多肽的92.34%，且酪氨酸酶抑制率能达到66.82%，因此这段多肽的性价比最高，可作为目标产品。将300 Da～4 kDa 水解液浓缩并喷雾干燥成粉状后，再配制成质量浓度为15 mg/mL的多肽溶液，测得酪氨酸酶抑制率为53.24%，比未加热浓缩的豌豆多肽抑制率减少了13.58%，下降率为20.32%，说明加热浓缩过程中可能会使多肽产生一定的聚合，使酪氨酸酶抑制活性下降。

表3 各段多肽的含量分布和酪氨酸酶活性抑制率

2.4 抑制酪氨酸酶活性的豌豆多肽质量浓度范围分析

多肽质量浓度与酪氨酸酶抑制率关系见图4。

图4 多肽质量浓度与酪氨酸酶抑制度关系曲线

从图4 可以看出，多肽质量浓度在5 mg/mL～25 mg/mL 范围内，酪氨酸酶抑制率与多肽质量浓度呈线性上升关系；超过25 mg/mL时，酪氨酸酶抑制率上升缓慢，因此，豌豆多肽的最佳作用质量浓度范围为5 mg/mL～25 mg/mL。

3 结论

试验结果表明，酸性蛋白酶一次水解豌豆多肽的适宜温度、时间和加酶量分别为：40 ℃～60 ℃、90 min～120 min 和5 000 μg-6 000 μg，豌豆蛋白和多肽二次水解的最佳用酶是NY50 中性蛋白酶。经过二次酶解，多肽得率和酪氨酸酶抑制率可达到47%和77%以上；膜分离得到的300 Da～4 KDa多肽的酪氨酸酶抑制率与多肽得率综合性价比最高，多肽质量浓度在5 mg/mL～25 mg/mL范围时，酪氨酸酶抑制率与多肽质量浓度呈量效关系。

豌豆蛋白粉是加工豌豆淀粉和豌豆粉丝产生的副产物，该蛋白粉在国内的深加工产品很少，本研究利用豌豆蛋白粉加工得到豌豆多肽，在多肽含量1.5%时酪氨酸酶抑制率为70%左右，具有良好的应用前景。