五种非常规使用化学物抗新型隐球菌体外药敏实验研究

杨玮 张思琴

新型隐球菌是一种环境来源重要致病真菌，人类可直接通过破损皮肤接触或通过呼吸将其孢子吸入体内，严重的可致隐球菌脑膜炎。每年大约超过100 万的病例感染新型隐球菌，致死率超过50%[1]，而在免疫力正常人中的爆发流行的菌株也越来越受到人们的关注。然而，目前常规使用的几种抗隐球菌药物因其治疗费用高、周期长、药物毒副作用强和难治复发性，严重威胁公众的生命安全[2,3]。因此，挖掘应用和丰富有效治疗药物迫在眉睫。雷夫康唑是一个近年来新研发的口服唑类广谱抗真菌的药物，然而国内研究其抗隐球菌的活性报道尚少见。舍曲林是选择性5-羟色胺摄取抑制剂，主要用于各种抑郁症及强迫症的治疗。近年来有学者研究发现舍曲林有快速的抗真菌作用[4，5]。小檗碱具有广泛的药理作用，可止痛止泻，并具有抗炎、抗癌、缓解血小板减少等作用。目前国内也有研究指出其抗真菌活性的作用[6,7]。布洛芬钠属于非甾体抗炎药，具有解热镇痛的功效，有文献报道该药具有一定的抗丝状真菌作用[8]。香芹酚为植物精油提取物，具有很高的抗氧化活性和抗菌活性[9,10]。因此本次研究尝试筛选几种化学物进行体外抗隐球菌药敏实验，以期为临床棘手治疗增加更多的药物选择提供一定的实验室参考依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 采集2018 年1 月至2021 年12 月杭州市中医院患者血液、脑脊液、肺泡灌洗液、皮肤创面标本，培养分离得到10 株新型隐球菌。经初步鉴定后再进行-80 ℃冷冻保存备用。鉴定及药敏实验质控菌株为近平滑念珠菌ATCC22019，由国家卫生健康委临检中心馈赠。

1.2 方法

1.2.1 质谱分子鉴定 将低温保存的10 株菌株复苏后转种哥伦比亚血平板35 ℃培养48 h后，在同等条件下再重新转种一代培养48 h 后，采用基质辅助激光解吸离子飞行质谱仪VTITEK MS IVD 3.2 数据库进行鉴定。

1.2.2 微量肉汤稀释法体外联合药敏实验

1.2.2.1 抗菌药物的配制 采用分析天平分别称取768 μg 的抗菌药物（盐酸舍曲林、小檗碱、氟康唑）分别加入100 μl的DMSO溶剂漩涡震荡仪进行震荡混匀充分，再加RPMI 1640 肉汤至1 ml，其中小檗碱还需加热煮沸10 min 至完全溶解。另外称取布洛芬钠干粉0.064 g 溶解于1 ml 蒸馏水中，香芹酚纯液0.0102 g 加入100 μl 的DMSO 溶剂加蒸馏水至1 ml。所有的原液分别采用0.22 μm 的滤膜进行过滤除菌，储存于4 ℃以备后续使用。

1.2.2.2 药敏肉汤配制 称取RPMI 1640 培养基干粉10 g 溶解于1 L 的蒸馏水中，116 ℃进行灭菌30 min，再用无菌吸管吸取0.165 mol/L 的MPOS 溶液，调pH至7.0，每批实验需新鲜配制。

1.2.2.3 菌液的配制 将低温冰箱复苏的菌种接种血平板，35 ℃培养48 h 后，取无菌生理盐水管用比浊仪调0.5 麦氏浊度菌液，从中取20 μl 菌液加入至20 ml 预先配制好的RPMI1640 肉汤进行1∶1000 的稀释，充分混匀即为药敏接种的菌液。

1.2.2.4 单药药敏实验 本次药敏实验参照CLSI M27-A3 酵母菌微量肉汤稀释法流程[11]进行。依次配制雷夫康唑最高浓度为8 μg/ml，氟康唑（目前临床常规使用药物）、舍曲林、小檗碱最高浓度为64 μg/ml，布洛芬钠最高浓度为32 mg/ml，香芹酚最高浓度为5096 μg/ml，采用96 孔微量肉汤稀释法加将药物依次倍比稀释，每孔加100 μl 药物再分别加10 株稀释菌液100 μl，混匀后35 ℃培养72 h 后观察结果，读取各菌株的90%菌株抑制生长的最低抑菌浓度（90% minimal inhibit concentration，MIC90）。质控菌株为近平滑念珠菌ATCC22019，观察结果并记录各种药物MIC90，试验重复操作3 次。

1.2.2.5 双药联合药敏实验 依次配制氟康唑、舍曲林、小檗碱最高浓度为64 μg/ml，布洛芬钠最高浓度为32 mg/ml，采用96 孔微量肉汤棋盘稀释法联合药敏。首先横纵向最外排孔分别加两种单药，其他框分别先后加两种药液50 μl（A药板内稀释、B药板外管内稀释再加入）再加100 μl 稀释后菌液，充分混匀，混匀后35 ℃培养72 h 后观察结果，读取各单药的MIC90 及部分抑菌浓度指数（fractional inhibitory concentration index，FICI）值，试验重复操作3 次。

FICI=MIC 甲药联用/MIC 甲药单用+MIC 乙药联用/ MIC乙药单用

FICI≤0.5 为协同作用，0.5＜FICI≤1.0 为相加作用，1.0＜FICI≤2.0 为无关作用，FICI＞2.0 为拮抗作用[11]。

2 结果

2.1 菌株来源分析 菌株D1、D2、D5、D7、D8 临床分离自脑脊液标本，D3 分离自肺保护性毛刷，D4 分离自血液，D6、D9 分离自支气管肺泡关灌洗液，D10 分离自皮肤脓液。10 株新型隐球菌在MALDI-TOF VITEK MS 3.2 数据库均鉴定为新型隐球菌，D2、D5、D7、D10 为荚膜缺陷株，其他为荚膜株。

2.2 各单药的MIC90的测定 五种药物对10株新型隐球菌均具有一定体外活性。其中雷夫康唑抗菌活性最强，MIC90为≤0.03 μg/ml。盐酸舍曲林MIC90为4～8 μg/ml，小檗碱MIC90为8～32 μg/ml，此二者药物活性已接近目前临床最常用药物氟康唑。此外，香芹酚与布洛芬钠及体外抗菌活性较差，MIC90分别为128～512 μg/ml，2000～8000 μg/ml。具体见表1。

表1 10株新型隐球菌对6种化学物的单药体外敏感性（MIC90/μg/ml）

2.3 联合药敏实验 通过前期单药的MIC90浓度测定结果，结合目前临床用药习惯选择适当的药物配伍：舍曲林、小檗碱、布洛芬分别与氟康唑以及三种药物两两组合对10 株新型隐球菌进行微量肉汤棋盘稀释法进行联合药敏，分别测定联合的MIC90值、计算FIC 指数并构建出药物浓度-累积抑菌百分率曲线图，见表2及封二图2。

图2 不同药敏组合抗新型隐球菌浓度-累积抑菌百分率曲线

表2 四种药物的双联合抗10株隐球菌体外药敏实的联用MIC90值/μg/ml

由表2 可见，舍曲林与氟康唑、氟康唑与小檗碱、舍曲林与小檗碱、联合后单药MIC90基本下降1～8 倍，FICI 分别为0.38～1、0.53～1.13、0.31～0.75。

由封二图2A～C 可见，SRT+FCA、FCA+BRB、SRT+BRB 双药组合均出现左移情况，两者药物之间表现出相加与无关作用。由封二图2D 可见，SRT+IBU 联合后药效在不同菌株的表现不一。而由封二图2E 可见，FCA+IBU 联合后浓度-累积抑菌百分率曲线明显右移，表现为明显拮抗作用。

3 结论

随着免疫低下人群的逐年增加及诊断技术水平的显著提高，目前隐球菌病越来越常见，其中包括肺隐球菌病、皮肤感染及全身系统性感染。然而，临床治疗用药仍然是个棘手的问题，尤其是隐球菌脑膜炎患者的临床用药。

雷夫康唑是2018 年日本学者研发的口服三唑类广谱抗真菌药物，不但具有抗念珠菌还可以抗丝状真菌作用，但目前国内有关其抗隐球菌活性的研究尚为少见。本实验初步发现，所有菌株均表现出高度一致的敏感，MIC90均≤0.031 μg/ml，活性显著优于目前临床使用的其他三唑类药物，且具有一定得杀菌活性，这与国内外报道相似[12～14]。除此之外，更为重要的是，有研究证实是雷夫康唑对其他唑类耐药的隐球菌菌株依然保持高效性[14]，其对丝状真菌感染仍可覆盖。因此，如此出色的新型三唑类药物单药就可在今后抗真菌治疗种发挥着不可替代的作用。

舍曲林是最强的选择性5-羟色胺再摄取抑制剂之一，主要用于各种抑郁症及强迫症的治疗。2001 年有学者首次发现了舍曲林的抗白念珠菌作用，同时对念株菌属的不同种及曲霉属的不同种有快速抗真菌作用[15，16，]。之后又有相关研究表明，舍曲林和伊曲康唑或两性霉素B的联合用药可以对某些曲霉起到协同作用[17]，更为重要的是舍曲林药物在脑脊液中药物浓度为血浆中的40 倍[18]，且舍曲林抗隐球菌活性明显优于其念珠菌，这为隐球菌脑膜炎治疗及临床复合性真菌感染提供很大优势。本研究发现，舍曲林抗各菌株MIC90表现基本为8 μg/ml，该结果与国内外报道非常相似[19,20]，舍曲林的抗隐球菌的机制与形成巨型脂质滴有关[21]。联合药敏显示与其他药物无拮抗作用，结合目前已有动物实验支持有效的研究，提示今后临床在处理复杂病例时单用或联合用药的可能性。

小檗碱为中药黄连中分离得到的一种季铵生物碱，具有广泛的药理作用，目前临床主要用于治疗腹痛和腹泻疾病。小檗碱不但对细菌有抑制作用外，近年来研究其抗真菌活性越来也多，其中抗隐球菌活性日益受关注。有报道指出小檗碱不仅对新生隐球菌具有杀菌效果，还能显著抑制新生隐球菌的有性生殖、荚膜大小以及产黑色素能力[22]。本实验数据显示小檗碱有较低的MIC90，不同菌株具有一定的差异，且尤其是其与氟康唑联合药敏表现为相加作用，指导临床可利用中药的多重药理性联合应用在隐球菌患者治疗上，充分发挥中西结合治疗的特色。布洛芬钠具有解热止疼的药效，为临床内外科广泛使用的药物。隐球菌患者尤其是脑膜炎患者常因剧烈头疼、发热等不适症状，常常使用该药物缓解。本实验重点研究了布洛芬钠与其他抗真菌药物的体外相互关系，如布洛芬钠与舍曲林为相加或无关作用，而其与氟康唑为拮抗作用，这可能导致临床常规处理联合用药时氟康唑的药效会降低，提示临床必须关注各药物的相互关系。此外，针对真菌关节炎外科处理时提示是否有使用水泥钉灌注该药物的可能，既可以局部缓解组织疼痛，又具有局部高浓度药物维持的抗真菌活性。此外，香芹酚本研究中MIC90相对较高，与国外报道较低值略有差异[23]，文献分析可能是实验条件会导致结果差别很大，后期仍需要进一步的体内外实验来明确。

本研究体外药敏实验并不能代表体内活性，因此药效的动物实验及临床应用数据需要进一步研究。