鹅星状病毒刺突蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

2022-12-13卢清侠金前跃郭振华冯丽丽邢云瑞柴书军邢广旭张改平

江苏农业科学 2022年22期

卢清侠，李伟，金前跃，郭振华，冯丽丽，邢云瑞，柴书军，邢广旭，张改平

(1.河南省农业科学院动物免疫学重点实验室，河南郑州 450002； 2.河南农业大学生命科学学院，河南郑州 4500023；3.河南省农业科学院农业经济与信息研究所，河南郑州 450002)

2016年以来，我国各地养鹅场相继暴发了一种雏鹅全身性痛风疫病，经病原分离鉴定，证实该疫病由鹅星状病毒(goose astrovirus，GAstV)感染引起[1-2]。该病毒主要感染5～20日龄雏鹅，临床症状表现为关节肿胀，解剖后可见肾脏与关节腔内有大量的白色尿酸盐沉积[3]，发病率为70%～80%，死亡率最高可达50%，给我国养鹅业造成了重大经济损失[4-5]。目前市场上缺乏有效的疫苗与药物，临床上主要通过控制饲料中的蛋白含量进行预防控制。快速准确诊断对于该病的临床防控具有重要的指导作用，目前主要通过RT-PCR和ELISA等检测方法来监控病毒感染[6-8]，尚缺少适合现场操作的快速检测技术。

GAstV是一种无囊膜的单股正链RNA病毒，基因组长度为6.8～7.9 kb，包括5′端非编码区(5′-UTR)，3′端非编码区(3′-UTR)，多聚腺苷酸(Poly A)尾巴和3个开放阅读框(open reading frame，ORFs)，分别是：ORF1a、ORF1b、ORF2[9]。ORF1a编码非结构蛋白，如核定位信号、丝氨酸蛋白酶等；ORF1b编码RNA依赖性RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase，RdRp)；ORF2编码的衣壳蛋白其中包含4个功能域：S、P1、P2和酸性C末端结构域( acidic C-terminal domain，ACTD)，其中P2结构域编码的Spike蛋白，构成病毒表面的刺突结构，是GAstV的主要保护性抗原蛋白，可以诱导机体的免疫反应[10-11]。本研究通过原核表达系统获得可溶性表达的截短Spike蛋白，制备出3株针对该蛋白的单克隆抗体，为建立有关GAstV 诊断方法提供了材料支持。

1 材料与方法

1.1 病毒、细胞和实验动物

pET-28a-Spike重组质粒由河南省农业科学院动物免疫学重点实验室保存；GAstV XX株(GenBank登录号：MN337323)由河南省农业科学院动物免疫学重点实验室分离、鉴定和保存；鸡肝癌细胞系(LMH)由河南省农业科学院动物免疫学重点实验室保存；BALB/c雌鼠购自济南朋悦实验动物繁殖有限公司。

1.2 主要试剂

质粒小量提取试剂盒购自北京天根生物公司；Ex-Taq酶、 DL2000 marker购自北京宝日医生物公司；Ni-NTA填料、His Trap excel预装柱购自美国GE生物公司，HRP-His单克隆抗体、羊抗鼠 IgG-HRP、山羊抗鼠IgG Alexa Fluor 488、鼠源单克隆抗体亚型鉴定试剂盒购自武汉三鹰生物公司；ECL显色液、胰蛋白酶、无血清细胞冻存液购自苏州新赛美公司；1 mol/L的Tris-HCl(pH值7.5)、IPTG、彩虹180广谱蛋白marker、AEC显色液、单组分TMB显色液、DMEM培养基、RPMI1640培养基购自北京索莱宝生物公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物公司；BL21(DE3)感受态细胞、澳洲胎牛血清购自北京全式金生物公司；HT、HAT、PEG-1500、弗氏完全佐剂与弗氏不完全佐剂购自美国Sigma-Aldrich生物公司。

1.3 Spike蛋白的表达与纯化

将构建好的pET-28a-Spike质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞，挑取单菌落转至1 mL含卡那霉素的LB培养基中，37 ℃、220 r/min振荡培养。当D600 nm值为0.6～0.8时，分别加入终浓度为0.5 mmol/L、1 mmol/L IPTG，16 ℃诱导表达14～16 h 后，12 000 r/min 条件下离心10 min 弃去培养基，重悬菌体沉淀，冰上超声破碎后再次离心，分别取上清与沉淀进行SDS-PAGE来检测蛋白的表达情况。将超声破碎后的菌液上清先用0.45 μm滤膜过滤，再用0.22 μm滤膜过滤，通过镍柱系统进行蛋白纯化，20 mmol/L咪唑缓冲液除去杂蛋白，100 mmol/L咪唑缓冲液洗脱并收集。将洗脱液转入透析袋，置于10 mmol/L Tris-HCl缓冲液中，4 ℃ 条件下利用磁力搅拌器搅拌。每隔30 min换液，至少换5次后结束透析。

1.4 Spike蛋白的鉴定

利用SDS-PAGE、Western-blot鉴定纯化后的蛋白，电泳结束后通过半干法转膜，然后用5%脱脂奶37 ℃封闭1 h，1 ∶2 000稀释的HRP-His单抗室温孵育1 h，用PBST洗涤3次，每次5～8 min，最后滴加ECL超敏显色液后凝胶成像仪显色。使用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白浓度的测定，分装后保存于-80 ℃冰箱。

1.5 Spike蛋白单克隆抗体的制备

1.5.1 小鼠免疫按1 ∶1的比例将Spike蛋白与弗氏完全佐剂乳化后，以200 μL/只(蛋白含量 30 μg)剂量皮下多点注射BALB/c小鼠，同时对照组的小鼠注射等体积的无菌PBS。2周后，按相同的比例、剂量与弗氏不完全佐剂充分乳化后进行二次免疫，之后每隔2周免疫1次小鼠，共免4次。在四免2周后通过断尾采血法收集10 μL血液加到 190 μL 的PBS中，5 000g离心8 min左右，吸取血清，利用ELISA方法检测小鼠血清效价。在融合前3 d，以50 μg/只的蛋白剂量腹腔注射到小鼠体内。

1.5.2 间接ELISA方法用CBS溶液将Spike蛋白稀释为2.5 μg/mL转入酶标板(100 μL/孔)后 37 ℃ 包被2 h，再用5%脱脂奶于37 ℃封闭1 h，小鼠的阴性、阳性血清倍比稀释后作为一抗，二抗为 1 ∶2 000 稀释的羊抗鼠IgG-HRP，PBST洗涤3～4次，经TMB显色后加入终止液，最后利用酶标仪读取各稀释度D450 nm值，当阳性血清D450 nm/阴性血清D450 nm>2.1所对应的最大稀释倍数为小鼠的抗体效价。

1.5.3 细胞融合与筛选用PEG-1500将对数生长期的骨髓瘤细胞与脾细胞按一定比例进行融合，待杂交瘤细胞密度达到孔底面积1/3左右时，吸取细胞上清通过ELISA进行初步筛选，并将相同载体的不同蛋白包板，利用ELISA进行反筛来排除针对His标签的假阳性杂交瘤细胞株。借助有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行2次亚克隆，通过ELISA、IPMA方法筛选出阳性单克隆细胞，置于液氮中冻存。

1.5.4 腹水制备提前2周向BALB/c小鼠腹腔内注射500 μL灭菌石蜡致敏，将PBS重悬的4×106个阳性单克隆细胞注射到小鼠腹腔，7 d左右观察到小鼠腹部明显膨胀，采集腹水，5 000 r/min 离心10 min吸取上清，-40 ℃保存。

1.6 单克隆抗体的鉴定

1.6.1 Western-blot鉴定 Spike蛋白进行SDS-PAGE后转膜进行分析，将按1 ∶500稀释的小鼠腹水作为一抗，室温孵育1 h，以1 ∶1 000稀释的羊抗鼠IgG-HRP作为二抗，室温孵育1 h，最后滴加ECL显色液，并在凝胶成像仪中成像。

1.6.2 IFA鉴定将LMH细胞经胰酶消化后，以每孔100 μL细胞转入96孔板，待细胞密度达到80%左右时，用无血清DMEM/F12(含1 μg/mL胰酶)将GAstV稀释100倍后接种到LMH细胞上，37 ℃ 培养2 h后，更换2%FBS-DMEM/F12维持液(含1 μg/mL胰酶)继续培养36 h。用预冷的甲醇固定20 min后，5%脱脂奶37 ℃温箱封闭1 h，一抗为1 ∶300稀释的腹水，二抗为1 ∶500稀释的山羊抗鼠IgG Alexa Fluor 488，经DAPI染核后，在荧光显微镜下观察并拍照保存。

1.6.3 效价与亚类的测定通过ELISA方法测定单克隆抗体的效价，CBS溶液包被Spike蛋白，分别以2倍倍比稀释的腹水作为一抗，羊抗鼠IgG-HRP作为二抗，最后利用酶标仪读取各稀释度D450 nm值。按照亚型鉴定试剂盒说明书进行单抗的亚类测定。

1.6.4 表位鉴定利用肽扫描方式筛选单克隆抗体的抗原表位，根据GAstV XX株的截短Spike蛋白序列合成了15个氨基酸的25条重叠肽，重叠长度为7个氨基酸，所合成多肽的纯度均大于95%。通过间接 ELISA 方法进行表位筛选，用CBS溶液将合成多肽稀释成为浓度2.5 μg/mL后转入酶标板(100 μL/孔)，每条多肽重复3个孔，4 ℃包被过夜或37 ℃包被2 h，以Spike 蛋白作为阳性对照，PBS作为阴性对照，用5%脱脂奶37 ℃温箱封闭1 h，一抗为1 ∶500稀释的3株单克隆抗体，1 ∶2 000稀释的羊抗鼠IgG-HRP为二抗，根据酶标仪读取D450 nm值鉴定单抗的抗原表位。通过Dot-blot方法进行表位鉴定，将1 μg合成肽点至硝化纤维素膜上，Spike蛋白为阳性对照，PBS为阴性对照，室温干燥后5%脱脂奶37 ℃封闭1 h，将1：500稀释的阳性血清单克隆抗体作为一抗，1 ∶2 000稀释的羊抗鼠IgG-HRP为二抗，PBST洗涤4次，最后用ECL试剂显影。

2 结果与分析

2.1 Spike蛋白的表达、纯化与鉴定

SDS-PAGE结果显示：IPTG诱导后，Spike蛋白在菌液上清中大量表达，1 mmol/L IPTG诱导表达的蛋白量比0.5 mmol/L 诱导表达的蛋白量高，故选择1 mmol/L IPTG进行Spike蛋白的诱导表达(图1)。

通过镍离子亲和层析纯化Spike蛋白，20 mmol/L 咪唑缓冲液洗杂，100 mmol/L咪唑缓冲液洗脱目的蛋白。对纯化后的Spike蛋白进行 SDS-PAGE、Western-blot鉴定， SDS-PAGE结果显示纯化的Spike蛋白大小正确，约为23 ku，且纯度较高，大约为95%(图2-A)。针对His标签的单克隆抗体免疫印迹分析显示，在大小为23 ku处出现了特异性的条带(图2-B)。进一步通过BCA蛋白定量试剂盒检测，确定了获得的纯化蛋白浓度为1.5 mg/mL。

2.2 单克隆抗体的筛选

2.2.1 小鼠免疫及血清效价的测定 Spike蛋白与弗氏佐剂充分乳化后皮下多点注射BALB/c小鼠，四免后利用断尾采集小鼠血清，通过ELISA方法检测血清效价。因小鼠个体的差异，血清效价不同，与其他3只小鼠相比，1号小鼠效价较高，达到 1 ∶512 000，故选择1号小鼠进行超免与细胞融合(图3)。

2.2.2 阳性单克隆杂交瘤细胞的筛选先利用ELISA方法初步筛选融合后的细胞，得到17孔阳性杂交瘤细胞，再将它们转到48孔板，待细胞密度达70%左右，通过ELISA、IPMA方法进行复筛，得到8株杂交瘤细胞，并对其进行亚克隆，最终利用ELISA方法筛选出3株阳性单克隆杂交瘤细胞，分别命名为1A5、2B4和12E6。利用IPMA对3株阳性单克隆杂交瘤细胞进行进一步鉴定，以3株阳性单克隆杂交瘤细胞的上清分别作为一抗，二抗为1 ∶500稀释的羊抗鼠IgG-HRP，AEC显色后在倒置显微镜下观察显色结果，显示2B4和12E6单克隆杂交瘤细胞的上清可以与GAstV发生特异性反应(图4)。

2.3 单克隆抗体的鉴定

2.3.1 Western-blot鉴定 Spike蛋白进行SDS-PAGE后转膜、封闭，再用5%脱脂奶将3株单克隆抗体(1 ∶500)分别稀释后作为一抗，通过Western-blot鉴定其与Spike蛋白的反应性。3株单克隆抗体均与Spike蛋白反应，且反应性较强(图5)。

2.3.2 IFA鉴定利用间接免疫荧光实验(IFA)鉴定单克隆抗体与GAstV的反应性，预冷甲醇将接种GAstV的LMH细胞板固定，以1 ∶300倍稀释的3株单抗分别作为一抗，以多少倍稀释的山羊抗鼠IgG Alexa Fluor 488作为二抗。结果显示，与阴性和阳性血清比较，2B4、12E6与GAstV发生特异性反应(图6)。

2.3.3 效价与亚型的鉴定利用ELISA方法检测3株单克隆抗体的效价：CBS溶液包被Spike蛋白，以2倍倍比稀释的腹水作为一抗，3株单克隆抗体均与Spike蛋白反应性良好，并且效价均在 1 ∶25 600 以上(图7-A)。利用亚型鉴定试剂盒测定3株单克隆抗体，根据D450 nm值判定单抗亚型，结果显示12E6 、 2B4单抗为IgG2b亚类，1A5单抗为 IgG2a亚类；3株单抗的轻链均为κ链(图7-B)。

2.3.4 抗原表位的鉴定利用多肽扫描方式筛选单克隆抗体的抗原表位，ELISA筛选的结果表明，单克隆抗体1A5识别的表位为：(EP16)ELRNRLNIADGDYVI；单克隆抗体2B4和12E6识别的表位为：(EP21)AGDSNPGETFQNFKM；它们均为Spike蛋白上的线性B细胞表位(图8-A)。利用Dot-blot方法对单克隆抗体进行进一步的表位鉴定，结果表明，与阳性血清对比，单克隆抗体1A5和2B4分别识别(EP16)ELRNRLNIADGDYVI和(EP21)AGDSNPGETFQNFKM，与ELISA鉴定结果一致(图8-B)。

2.3.5 抗原表位的空间分布利用SWISS-MODEL软件以TAstV-2 Spike蛋白(PDB：3TS3)的晶体结构为模板进行同源建模，获得Spike蛋白的三维结构，其以同源二聚体形式存在(图9-A)。

之后使用PYMOL软件绘制B细胞表位EP16，EP21在Spike蛋白结构上的位置。由图9-B可见，抗原表位(EP16)ELRNRLNIADGDYVI位于Spike蛋白结构的侧面(红色)，而抗原表位(EP21)AGDSNPGETFQNFKM位于 Spike蛋白单体的顶部(黄色)。

3 讨论

鹅星状病毒主要感染雏鹅，其特征为痛风、肾脏出血和肿胀，发病率较高。据统计，该病已经造成12亿～15亿元的经济损失。常规的PCR检测方法受环境、技术的限制，在养鹅企业很难得到应用，因此建立快速、简便的GAstV抗原诊断技术对于该病的防控十分重要[12]。而基于单克隆抗体的胶体金免疫层析检测技术具有快速、简便、不依赖任何设备的特点，同时具有良好的特异性和敏感性，非常适合疫病的现场即时检测[13，14]。在本研究中，我们制备了3株针对Spike蛋白的特异性单克隆抗体，为后期研发针对GAstV的胶体金试纸条等抗原检测方法提供了材料。

线性B细胞表位可以为疫苗设计和诊断方法开发提供潜在候选位点[15]。Ren等制备了针对 His-P2-ACTD 蛋白的单克隆抗体，并鉴定出3个线性表位，首次开发了基于单抗的夹心ELISA方法用于检测GAstV。Xu等利用水稻胚乳表达的猪瘟病毒(CSFV) E2蛋白免疫小鼠，获得了相应的单克隆抗体，发现其中2株具有中和活性，鉴定出的表位P33能够区分猪瘟病毒抗体与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗体，并为新疫苗的设计和鉴别诊断提供了理想的候选肽[16]。本研究鉴定出2条线性抗原表位，为GAstV疫苗和诊断技术的开发奠定了基础。