水稻土中土著细菌群落对重金属Cd的响应

吴 玲

(1.常州工程职业技术学院检验检测认证学院，江苏常州 213164；2.南京师范大学地理科学学院江苏省物质循环与污染控制重点实验室，江苏南京 210023)

随着工农业的发展以及在人类活动的影响下，重金属引起的土壤污染问题越来越严重。重金属污染物易积累、难降解且毒性大，能够破坏土壤生态环境及土壤结构，使土壤变得贫瘠，并导致土壤肥力下降[1]。土壤中的重金属主要来源于风化作用、工业废水、农业化学物的排放以及空气中有毒气体在雨水冲刷下与土壤的混合作用[2]；同时，土壤中的重金属还能通过渗透作用回到周围的大气与水体中[3]。我国是水稻种植大国，水稻土遭受不同程度及不同种类的重金属污染，其中，镉生物毒性极强，是土壤中较为常见的重金属污染元素，能够被稻米富集，因此受到广泛关注[4-5]。

土壤微生物能够参与C、N等多种营养元素的循环过程，在维持土壤结构中发挥了重要的作用，高丰度的土壤微生物群落对于维持土壤功能具有重要的作用[6]。在重金属的胁迫下，土壤中微生物量及活菌菌落数量明显下降，且土壤微生物群落结构和功能均发生变化[7-8]。研究表明，与其他生物相比，土壤微生物对重金属更加敏感，重金属污染能够干扰土壤微生物的生长、形态和代谢[9]。Ros等研究证实，Cd污染能影响半干旱土壤中的微生物活性、群落丰度与群落结构[10]；大量的室内与野外试验证实，重金属Cd能够影响土壤微生物，并对土壤微生物产生最强烈的副作用，且不同的微生物对重金属Cd具有不同的耐受性，微生物群落结构同时也是指示土壤重金属污染的重要指标[11-12]。水稻土是具有干湿交替特征的特殊的农田土壤，研究不同浓度Cd对水稻土中土著细菌群落的影响是筛选土著耐Cd细菌的前提和基础，而耐重金属菌株的筛选是研究土壤微生物修复的重要环节。因此，本研究结果对当地土壤重金属修复具有重要意义[13]。

1 材料与方法

1.1 样品采集

采集0～15 cm深度的自然生态系统土壤作为供试土，去除表面落叶、植被及颗粒物后，将土壤置于室内自然风干后研磨过筛，备用。

1.2 水稻盆栽试验设置

在15 cm×20 cm(R×H)的塑料盆中装土约 2 kg，将一定浓度的CdCl2·2.5H2O溶液加入盆中与土混合均匀，配制成Cd终浓度分别为0、20、40、80、160 mg/kg的土壤，每个浓度设置6个平行。在土壤中以1 ∶1 ∶1(质量比)施入N-P2O5-K2O肥料并浇水使土润湿，放置平衡2周。2019年5月初在江苏武进水稻研究所(中国常州)实验室进行水稻育苗，选取苗龄2周，生长一致的秧苗移栽至塑料盆，放置于常州工程职业学院(中国常州)知行楼顶楼露台，接受自然光照，用自来水浇灌，盆中保持 3～5 cm水层，模拟水稻150 d左右的生长周期。

1.3 水稻根际与非根际土的采集

在水稻生长的成熟期进行破坏性采样，采集不同Cd含量(0、20、40、80、160 mg/kg)的根际与非根系水稻土共10个样品，每个样品采集3个平行样。根据文献，采用抖落法收集区分根际土和非根际土[14]。将采集的水稻根际与非根际土壤一部分用于土壤理化指标分析，一部分用于分子生态学研究。

1.4 水稻土理化性质的测定

pH值的测定：按2.5 ∶1的水土比用蒸馏水浸提水稻土，振荡10 min并静置30 min，用Mettler-Toledo S220-K-CN台式pH计测定悬浊液pH值；无机氮的测定：按5 ∶1的水土比用2 mol/L KCl提取，并用Skalar San Plus连续流动分析仪(荷兰Skalar分析仪器公司)测定无机氮的浓度；采用凯氏(Micro-Kjeldahl)定氮法测定总氮(total nitrogen，TN)含量；采用重铬酸钾氧化-分光光度法测定总有机碳(total organic carbon，TOC)含量[15]。

1.5 宏基因组DNA的提取

采用FastDNA® SPIN Kit for Soil试剂盒(MP Biomedicals，美国)，参照使用说明书，将新鲜的水稻土样品混匀，提取宏基因组DNA，并测定其浓度与纯度。

1.6 高通量测序

使用通用引物515F(5′-G T G C C A G C M G C C G C G G-3′)和907R(5′-C C G T C A A T T C M T T T R A G T T T-3′)对水稻土中原核微生物16S rRNA基因进行扩增，对PCR扩增产物进行切胶分离，委托上海美吉生物(中国上海)进行高通量测序。

1.7 数据分析

利用SPSS 18.0软件通过单因素方差分析(One-way analysis of variance)和Tukey多重比较评估不同Cd含量的水稻土理化指标之间的差异，P<0.05表示数据之间有显著差异。利用美吉生信云平台(http：//cloud.majorbio.com)将测序得到的OTU序列进行在线分析，主要包括微生物群落结构分析，香农指数(Shannon index)、Sobs指数及文库覆盖率(Coverage)的计算，水稻土Cd含量、理化指标与纲水平主要细菌类群丰度的Spearman相关性分析。

2 结果与分析

2.1 不同Cd含量的水稻土理化指标分析

2.2 不同Cd含量的水稻土高通量测序结果初步分析

不同Cd含量的水稻土中微生物16S rRNA基因Illumina高通量测序结果如表2所示， 10个水稻土样品共获得1 313 418条有效序列，且序列平均长度分别为376 bp。

表1 水稻根际与非根际土理化指标

表2 基于16S rRNA基因的水稻土样品高通量测序结果

由OUT水平的Sobs稀释曲线可得，水稻土样品中的16S rRNA基因高通量测序所得的Sobs指数平均值在1 496～2 468之间，稀释曲线趋向平坦，说明测序数据量合理(图1-a)；Shannon指数表示菌群多样性指数，数值越大，微生物多样性越高，基于16S rRNA基因测序结果的Shannon指数在4.69～6.40之间，曲线趋向平坦，说明测序数据量足以反映水稻土样品中大部分微生物的多样性信息(图 1-b)，且随着水稻土中Cd浓度的上升，RS-160水稻样品Shannon指数明显低于其他组。Coverage值在0.97～0.98之间，说明测得的OTU基本能够反映水稻土样品中微生物群落结构组成(表2)。

2.3 不同Cd含量的水稻土中微生物群落结构变化与多样性分析

对高通量测序获得的所有OUT序列进行界(Kingdom)、门(Phylum)、纲(Class)、目(Order)、科(Family)、属(Genus)、种(Species)水平上的物种分类。通过16S rRNA基因测序结果可知，不同Cd含量的水稻土样品中的原核微生物主要为细菌界，共有35个门，相对丰度前11位的细菌类群包括变形菌门、酸杆菌门、放线菌门、绿弯菌门、拟杆菌门、蓝细菌门、厚壁菌门、浮霉菌门、芽单胞菌门、己科河菌门、匿杆菌门，其中变形菌门在各水稻土样品中均表现出优势，其在水稻土样品中的相对丰度平均值在32.1%～41.9%之间；共有94个纲，相对丰度前10位优势菌群包括γ-变形菌纲、放线菌纲、subgroup-6、α-变形菌纲、拟杆菌纲、厌氧绳菌纲、δ-变形菌纲、生氧光细菌纲、梭菌纲、芽单胞菌纲(图2)。

2.4 不同Cd含量的水稻土中微生物群落结构变化影响因素

3 讨论与结论

土壤细菌是土壤中最重要的类群，对土壤中的重金属污染物十分敏感[16-17]。当土壤中重金属的浓度较高时，有些细菌数量会减少或绝灭，但耐重金属细菌数量会增加并累积，因此，长期遭受重金属污染的土壤细菌的群落数量与结构可能发生显著的变化[18]。本研究通过基于16S rRNA基因的高通量测序技术分析可得，不同Cd含量的水稻土中原核微生物主要为细菌界以及其下35个门和94个纲，Sobs指数平均值在1 496～2 468之间，Shannon指数分布在4.69～6.40之间。由不同Cd含量的水稻土中门水平微生物群落分布图可知，变形菌门在各水稻土样品中均表现出优势，并以γ-变形菌纲为主，其次为α-变形菌纲与δ-变形菌纲。变形菌门大多数兼性或者专性厌氧及异养生活，俎千惠等对不同纬度地区水稻土细菌群落的研究显示，不同纬度的8个典型地区的水稻土均以变形菌门中的α和β分支为主[19]。