环介导等温扩增技术对慢性阻塞性肺疾病急性加重伴下呼吸道感染的诊断价值

温雅，杜焰家，黄娟，曾汉华，钟子双，张伟强

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是以持续气流受限为特征的呼吸系统疾病，下呼吸道感染是慢性阻塞性肺疾病急性加重（acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease，AECOPD）的常见合并症，但长期接受抗感染治疗的AECOPD患者细菌耐药情况严重、治疗难度增加［1］。目前，临床上主要通过呼吸道病原菌培养方法明确AECOPD伴下呼吸道感染患者的致病菌，但该方法耗时较长，容易错过最佳治疗时机［2］。环介导等温扩增技术（loop mediated isothermal amplification，LAMP）可以进行多种细菌、结核分枝杆菌的核酸检测，具有快速、敏感等优势，可早期明确致病菌，为抗菌药物的选择提供依据［3-4］。鉴于LAMP的优势，将其用于AECOPD伴下呼吸道感染的诊断或可进一步提高其诊断效能。为此，本研究分析了LAMP对AECOPD伴下呼吸道感染的诊断价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2020—2021年在梅州市人民医院住院的AECOPD伴下呼吸道感染患者500例，均符合《慢性阻塞性肺疾病急性加重诊治中国专家共识（草案）》［5］中的AECOPD诊断标准，且经影像学检查确诊为下呼吸道感染，血清炎症指标升高，提示伴有下呼吸道细菌或非典型病原体或结核杆菌感染。所有患者中男433例，女67例；年龄（72.2±9.9）岁；有吸烟史316例（占63.20%）；行机械通气328例（占65.60%）；合并症：高血压137例（占27.40%），冠心病73例（占14.60%），2型糖尿病52例（占10.40%）。本研究经梅州市人民医院医学伦理委员会审核批准（梅市伦审2020-CY-18）。

1.2 纳入、排除及剔除标准 纳入标准：（1）年龄18～100岁；（2）患者和/或家属同意留取痰液或支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）并送检；（3）采用敏感抗生素治疗或抗结核治疗有效。排除标准：（1）不适合行电子支气管镜检查及镜下支气管肺泡灌洗术者；（2）合并其他脏器严重感染、HIV感染者。剔除标准：（1）采集的标本不符合临床检验标准者；（2）检测结果提示可能存在标本污染者。

1.3 研究方法 本研究为横断面研究。患者入院后留取痰液或BALF，同时采用LAMP和病原菌（细菌、真菌、结核分枝杆菌）培养方法进行检测。共500份标本采用LAMP方法检测，其中痰液336份、BALF 164份；共530份标本采用病原菌培养方法进行检测，其中28例患者同时进行细菌+真菌和结核分枝杆菌培养，2例患者同时进行两份细菌+真菌培养。

1.3.1 BALF、痰液的采集及处理 参考《成人诊断性可弯曲支气管镜检查术应用指南（2019年版）》［6］及《肺部感染性疾病支气管肺泡灌洗病原体检测中国专家共识（2017年版）》［7］操作规范。电子支气管镜检查术前做好禁食禁水准备，采取利多卡因局部麻醉/局部麻醉+镇静镇痛的麻醉方式；术中全程监测患者呼吸、血压、脉搏、指脉氧，观察患者的临床症状；术后嘱患者禁食、禁水2 h，并观察患者术后不良反应发生情况。根据胸部CT定位将支气管镜经鼻插入至目标亚段支气管，病变局限者选择病变段，弥漫性病变者选择右肺中叶或左上叶舌段，清除局部痰液后注入室温0.9%氯化钠溶液30～60 ml，进行病变部位支气管肺泡灌洗，回收15～30 ml BALF，要求回收率≥30%。患者在医务人员指导下自主咳出深部痰液或在电子支气管镜下吸出痰液，标本符合《全国临床检验操作规程（第4版）》［8］，2 h内送检实验室。

1.3.2 LAMP LAMP为呼吸道病原菌核酸联合检测，首先采用细菌DNA提取试剂盒（博奥生物集团有限公司）提取病原菌DNA，按照呼吸道病原菌核酸检测试剂盒（博奥生物集团有限公司）说明书，采用等温扩增法和微流控芯片法相结合的方法，对病原菌进行检测，24 h内可获得结果。采用呼吸道病原菌核酸检测软件对检测结果进行可视化分析，本研究共检测到13种病原菌：肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、结核分枝杆菌复合群。

1.3.3 病原菌培养方法 按照临床常规细菌/真菌培养操作标准，将标本接种在已处理的培养皿中，经恒温培养箱，采用VITEK2自动微生物分析仪检测细菌，采用真菌分析仪检测真菌，采用液基培养方法检测结核分枝杆菌。

1.4 统计学方法 采用SPSS 23.0统计学软件处理数据。符合正态分布的计量资料以（±s）表示；计数资料以〔n（%）〕表示，组间比较采用χ2检验或McNemar配对检验；LAMP与病原菌培养方法检测病原菌的一致性分析采用Kappa检验，其中Kappa值≥0.75提示一致性高、0.40≤Kappa值＜0.75提示一致性一般、Kappa值＜0.40提示一致性差。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LAMP检测结果 LAMP检测结果显示，BALF中病原菌检出率为30.49%（50/164），痰液中病原菌检出率为45.24%（152/336）；痰液中病原菌检出率高于BALF，差异有统计学意义（χ2=9.958，P=0.002）。其中行机械通气者耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌检出率及单一感染发生率高于未行机械通气者，结核分枝杆菌复合群检出率低于未行机械通气者，差异有统计学意义（P＜0.05）；行机械通气者与未行机械通气者肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌检出率及混合感染发生率比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 行机械通气者与未行机械通气者LAMP检测结果比较〔n（%）〕Table 1 Comparison of LAMP detection results between patients with mechanical ventilation and patients without mechanical ventilation

2.2 LAMP与病原菌培养方法检测结果比较 采用LAMP检出病原菌202份，病原菌检出率为40.40%（202/500）；采用病原菌培养方法检出病原菌130份，病原菌检出率为24.53%（130/530）。LAMP的病原菌检出率高于病原菌培养方法，差异有统计学意义（χ2=29.671，P＜0.001）。其中LAMP对肺炎链球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、单一感染、混合感染检出率高于病原菌培养方法，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 LAMP与病原菌培养方法检测结果比较〔n（%）〕Table 2 Comparison of detecting result between LAMP and pathogen culture

2.3 LAMP与病原菌培养方法检测病原菌结果的一致性LAMP与病原菌培养方法检测铜绿假单胞菌结果的Kappa值为0.708，检测金黄色葡萄球菌结果的Kappa值为0.611，检测嗜麦芽窄食单胞菌结果的Kappa值为0.421，见表3。

表3 LAMP与病原菌培养方法检测病原菌结果的一致性分析（例）Table 3 Consistency analysis of LAMP and pathogen culture methods in detecting pathogenic bacteria

3 讨论

下呼吸道感染是诱发AECOPD的主要因素之一，尤其是肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌等细菌，其进入下呼吸道后会损伤患者肺功能，加重患者咳喘、呼吸困难症状，甚至危及患者生命［9］。本研究中500例AECOPD伴下呼吸道感染患者以老年男性为主，大部分患者有吸烟史，接受过机械通气治疗。老年患者机体功能减退，抵抗力减弱，容易并发下呼吸道感染；烟草中的尼古丁、一氧化碳等有毒物质会加重COPD患者的呼吸道损伤，增加病原菌感染风险；接受机械通气治疗亦可增加呼吸道感染发生概率［10-11］。目前，临床上主要通过临床特征与症状及胸部CT检查结果确定COPD患者是否伴发下呼吸道感染［12］，但无法明确其感染病原菌的类型，故需要进一步明确病原菌以采取针对性治疗。但由于病原菌的体外培养条件苛刻，且培养时间较长，假阴性结果较多，导致仅有部分COPD患者可在痰液中发现病原菌［13］。

近年来随着支气管肺泡灌洗技术的广泛应用，BALF检查得到普及，这为AECOPD伴下呼吸道感染患者的病原菌检测提供了有利条件［14］。本研究结果显示，痰液中病原菌检出率高于BALF，其原因可能与痰液中病原菌含量更高有关；且LAMP对病原菌的检出率高于病原菌培养方法。本研究中500例AECOPD伴下呼吸道感染患者以单一感染为主，革兰阴性菌感染居多，其中行机械通气者以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌感染为主，未行机械通气者以流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌复合群感染为主，且行机械通气者耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检出率高于未行机械通气者。既往研究表明，我国下呼吸道感染患者感染病原菌以革兰阴性菌为主，其中肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌均为常见条件致病菌，其广泛存在于自然界，对免疫力低下者可造成严重危害；铜绿假单胞菌具有黏多糖与鞭毛，容易黏附在呼吸道黏膜上皮，引起呼吸道感染［15-17］。一项病原菌分离及耐药研究显示，不同病程的COPD患者感染的病原菌均以革兰阴性菌为主，主要为鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌等［18］。国外研究表明，AECOPD患者采用痰培养分离出的病原菌主要为铜绿假单胞菌（38.23%）、肺炎克雷伯菌（29.41%）、金黄色葡萄球菌（23.53%）、肺炎链球菌（5.88%）［19］。因COPD患者经常使用抗生素、糖皮质激素及接受机械通气治疗，故其常伴有肺部重症感染，导致条件致病菌耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染比例升高［20］。此外，老年COPD患者因气道慢性炎症也容易并发结核分枝杆菌感染［21-23］。上述研究结果存在的差异亦提示，下呼吸道感染的病原菌分布可能与地域、种族、合并疾病、治疗方法等有关。

本研究结果显示，LAMP对肺炎链球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌的检出率高于病原菌培养方法，提示LAMP对于一些苛养菌、条件致病菌的诊断效能较病原菌培养方法好，对于病原菌培养方法容易检测的病原菌，LAMP也较敏感；但LAMP与病原菌培养方法检测铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、嗜麦芽窄食单胞菌结果的一致性一般，检测其他病原菌结果的一致性较差。LAMP是一种利用分子生物学分析病原菌核酸的检测技术，可同时分析十多种常见病原菌，故可为AECOPD伴下呼吸道感染患者的抗菌药物选择提供依据；此外，该技术最快可在2 h内出具检测结果，具有迅速、便捷等优点［24-26］。

综上所述，与病原菌培养方法相比，LAMP对AECOPD伴下呼吸道感染患者的病原菌检出率更高，尤其是肺炎链球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌等苛养菌或条件致病菌；且采用LAMP检测AECOPD伴下呼吸道感染患者时，其痰液中病原菌检出率高于BALF。但本研究为单中心研究，且样本量有限，未来仍需要多中心、大样本量研究进一步验证本研究结论。

作者贡献：温雅、杜焰家进行文章的构思与设计、结果分析与解释；温雅、张伟强进行研究的实施与可行性分析；温雅、黄娟、曾汉华、钟子双进行数据收集、整理、分析；温雅撰写、修订论文，负责文章的质量控制及审校，并对文章整体负责、监督管理。

本文无利益冲突。