补阳还五汤对急性缺血再灌注损伤大鼠的作用机制研究

王稳平 赵晓娟

(1 渭南市中医医院内科，渭南，714000； 2 渭南职业技术学院护理学院，渭南，714000)

脑梗死是临床上常见的缺血性脑血管疾病，随着近年来溶栓、介入治疗等治疗方法的推广，脑梗死患者能够早期接受再灌注治疗，病情的转归得到改善。但是，部分脑梗死患者在经历脑组织缺血再灌注的过程后神经损伤加剧，表现出较高的致死率和致残率，需要及早进行干预。中医认为脑梗死属于“中风”范畴，气虚为本、痰瘀互结为标，气虚血瘀是“中风”发生的主要病机，补气祛瘀是治疗中风的关键[1-2]。补阳还五汤由黄芪、川芎、当归、赤芍、桃仁、地龙等中药组成，具有补气祛瘀、行气活血功效，用于脑梗死的治疗能够减轻神经功能损害、降低血黏度，但关于补阳还五汤治疗缺血再灌注损伤尚未见报道[3-4]。为了明确补阳还五汤在大脑缺血再灌注过程中的治疗价值，本研究具体分析了补阳还五汤对急性大脑缺血再灌注损伤大鼠的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 30只无特定病原体(Specific Pathogen Free,SPF)级SD大鼠、10～12周龄、体质量250～300 g，购自上海斯莱克实验动物公司、生产许可SCXK(沪)2017-0005，饲养温度22～26 ℃、40%～60%湿度，自由摄食饮水。本实验经医院动物福利伦理委员会批准通过(伦理审批号：2019032401)。

1.1.2 药物 补阳还五汤水溶液由渭南市中医医院药剂科制备。

1.1.3 试剂与仪器 超纯RNA提取试剂盒(DNaseⅠ)(北京康为世纪公司，货号：CW0581S)、SuperRT cDNA第一链合成试剂盒(北京康为世纪公司，货号：CW0741S)、UltraSYBR Mixture试剂(北京康为世纪公司，货号：CW0957S)，基因引物(上海生工公司，货号：CW0659S)。

1.2 方法

1.2.1 分组及模型制备 将30只SPF级SD大鼠随机分为假手术组、模型组、干预组，每组10只。模型组、干预组按照下列方法建立大脑缺血再灌注损伤模型：腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后摆放仰卧位，做颈正中切口后分离左侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，用动脉夹夹闭颈总动脉及颈内动脉，用缝线结扎颈外动脉，在颈外动脉远端做一小切口，将预先制作好的栓线由切口插入、直至大脑前动脉，松开颈总动脉及颈内动脉的动脉夹，逐层缝合切口；2 h后拔出栓线、使血流恢复再灌注。假手术组分离颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，但不进行夹闭及结扎操作。

1.2.2 给药方法 干预组大鼠在造模前给予补阳还五汤干预，剂量按照人的临床剂量142.5 g/60 kg计算、为14.84 g/kg，灌胃，2次/d，连续14 d；假手术组和模型组给予生理盐水灌胃，2次/d，连续14 d。最后1次灌胃结束后禁食过夜，第2天进行造模。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 神经行为学评分 再灌注24 h后，按照下列标准进行神经行为学评分：1)无神经功能缺损的症状为0分；2)垂直提起患侧肢体时，前肢不能伸展为1分；3)行走时向患侧转圈为2分；4)行走时向患侧倾倒为3分；5)意识低、不能自发行走为4分。

1.2.3.2 脑组织含水量测定 完成神经行为学评分测定后处死大鼠，解剖得到缺血再灌注侧脑组织，迅速测量重量为湿重；将脑组织在105 ℃高温烤箱内干燥48 d后称量重量为干重，脑组织含水量=湿重-干重/湿重×100%。

1.2.3.3 基因表达量的检测 完成神经行为学评分测定后取缺血再灌注侧脑组织，采用超纯RNA提取试剂盒(DNaseⅠ)分离组织中的RNA，采用SuperRT cDNA第一链合成试剂盒将脑组织提取得到的RNA反转录为cDNA；取cDNA 1 μL、UltraSYBR Mixture试剂10 μL、引物1 μL、去离子水8 μL混匀为PCR体系，按照程序95 ℃ 20 s、特异性退火温度25 s、72 ℃ 30 s重复40个循环，得到循环阈值(Ct)后计算基因的表达水平。见表1。

表1 基因的引物序列及退火温度

2 结果

2.1 各组大鼠间神经行为学评分比较 进行大脑缺血再灌注造模的模型组及干预组大鼠神经行为学评分均明显升高；造模前接受补阳还五汤干预14 d的干预组大鼠的神经行为学评分明显低于模型组，2组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠间神经行为学评分比较分)

2.2 各组大鼠间脑组织含水量的比较 进行大脑缺血再灌注造模的模型组及干预组大鼠脑组织含水量均明显升高；造模前接受补阳还五汤干预14 d的干预组大鼠的脑组织含水量明显低于模型组，2组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠间脑组织含水量的比较

2.3 各组大鼠缺血再灌注病灶内Bax、Bcl-2、胱天蛋白酶-3的mRNA表达水平比较 进行大脑缺血再灌注造模的模型组及干预组大鼠缺血再灌注病灶内Bax、胱天蛋白酶-3的mRNA表达水平均明显升高，Bcl-2的mRNA表达水平均明显减少；与模型组比较，造模前接受补阳还五汤干预14 d的干预组大鼠缺血再灌注病灶内Bax、胱天蛋白酶-3的mRNA表达水平均明显减少，Bcl-2的mRNA表达水平均明显增多，差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表4。

表4 各组大鼠缺血再灌注病灶内Bax、Bcl-2、胱天蛋白酶-3的mRNA表达水平比较

2.4 各组大鼠缺血再灌注病灶内磷脂酰肌醇3激酶、蛋白激酶B的mRNA表达水平比较 进行大脑缺血再灌注造模的模型组及干预组大鼠缺血再灌注病灶内磷脂酰肌醇3激酶、蛋白激酶B的mRNA表达水平均明显减少；造模前接受补阳还五汤干预14 d的干预组大鼠缺血再灌注病灶内磷脂酰肌醇3激酶、蛋白激酶B的mRNA表达水平均明显增多，与模型组比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表5。

表5 各组大鼠缺血再灌注病灶内磷脂酰肌醇3激酶、蛋白激酶B的mRNA表达水平比较

3 讨论

脑梗死属于中医理论中“中风”的范畴，人事不省伴有口角偏斜、言语謇涩和瘫痪是常见的临床症状。中风的中医病机复杂且具有多样性，其中气虚血瘀是受到广泛认可的中医病机[5]。《黄帝内经·素问·生气通天论》中记载：“阳气者，精则养神，柔则养筋。”《医林改错》中明确指出：“亏损元气、是其本源”“元气即虚、血管无气、必停留而瘀。”阳气亏虚则血运不畅，进而导致瘀血内停、阻塞脑络并发生中风[6-7]。脑梗死治疗的关键是早期再通血管、恢复缺血脑组织的血流灌注，但缺血再灌注过程同样会引起脑组织损伤，需要积极进行防治。中医理论中尚缺乏对大脑缺血再灌注的直接描述，但大脑缺血再灌注损伤所涉及的病理环节与大脑缺血缺氧损伤所涉及的病理环节类似，因而二者也具有相似的中医病机，针对性地进行补气祛瘀治疗具有积极作用。

补阳还五汤是由黄芪、川芎、当归、赤芍、桃仁、地龙等药物组成的中药方剂，黄芪作为君药，具有补气固表的功效；川芎、当归为臣药，具有活血补气的功效，与君药联用可以提升君药的功效；赤芍、桃仁、地龙等为佐药，具有散瘀活血的功效，能够帮助君药和臣药直达经络，发挥最大效果。诸味药物联合使用，能够起到补气祛瘀、活血固表、通络散结的作用[8-9]。《医学衷中参西录》中记载：“气之上升者过少、可使脑部贫血，无以养其脑髓神经。”针对“中风”气虚血瘀的病机给予补气祛瘀的药物能够进行对症治疗[10-11]。补阳还五汤也被临床研究证实能够改善中风患者的神经功能[12-13]。本研究对大脑缺血再灌注模型大鼠给予补阳还五汤治疗，结果发现，干预组的神经行为学评分及脑组织含水量均明显下降，提示补阳还五汤能够减轻大脑缺血再灌注大鼠的神经损伤。

现代药理学关于补阳还五汤的研究认为，黄芪、川芎、当归、赤芍、桃仁、地龙等药物具有组织保护作用，通过阻断组织细胞凋亡而减轻组织在病理条件下的损伤[14-15]。缺血再灌注过程中细胞凋亡的过度激活是造成脑组织损害的重要病理因素，本研究对缺血再灌注模型大鼠脑组织中相应基因的分析发现：模型组大鼠脑组织中Bax、胱天蛋白酶-3的表达水平均明显升高，Bcl-2、磷脂酰肌醇3激酶、蛋白激酶B的表达水平均明显减少。Bax和Bcl-2是调控凋亡的一对分子，前者促凋亡，后者抗凋亡，最终作用于胱天蛋白酶-3来直接介导细胞凋亡[16-17]；PI3K/AKT信号通路是上游调节凋亡的信号通路，该通路的激活能够使Bcl-2激活、Bax失活，进而阻碍胱天蛋白酶-3的活化及细胞凋亡[18-20]。本研究用补阳还五汤干预后发现：干预组大鼠脑组织中Bax、胱天蛋白酶-3的表达水平均明显减少，Bcl-2、磷脂酰肌醇3激酶、蛋白激酶B的表达水平均明显增多，提示补阳还五汤能激活缺血再灌注脑组织中PI3K/AKT通路介导的抗凋亡作用。

综上所述，补阳还五汤能够减轻模型大鼠的急性大脑缺血再灌注损伤，其作用机制可能与PI3K/AKT信号通路介导的凋亡抑制作用有关。