中性粒细胞胞外捕获网防御机制的研究进展

谢何昕，鲁文赓，司琳清，袁思琦，周继伟，姚旭东

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆 163319）

中性粒细胞胞外捕获网（neutrophil extracellular traps，NETs）是起源于细胞核的非高密度染色质纤维[1]。中性粒细胞（PMN）由于其大部分呈分叶状核，小部分呈杆状，又被称为多形核白细胞。作为最丰富的白细胞类型，PMN在骨髓中发育成熟并释放到外周血液中，在外周血中循环约6～8 h，在组织中可存活数天。PMN可通过吞噬、脱颗粒和产生NETs对抗入侵的微生物[2-3]。NETs可杀死多种病原体，如细菌、真菌和寄生虫，同时还可防止微生物扩散。PMN作为主要的抗菌和吞噬细胞，作为先天免疫系统的第一道防线起到重要作用[4]。

PMN能够迅速到达早期的炎症感染部位并击败微生物病原体，其消灭病原体的机制除了吞噬作用，还包括NETs的产生和释放。NETs的释放有两种主要途径，分别为：中性粒细胞的炎性死亡方式（NETosis）细胞死亡途径[1]，其始于核脱孔和核膜的解体，细胞极化丧失、染色质去浓缩和质膜破裂释放NETs。NETosis细胞非溶解性形式，可以独立于细胞死亡发生，涉及染色质的分泌排出并伴随颗粒蛋白脱颗粒释放NETs。在NETosis最后阶段中，其核膜破裂，核染色质进入细胞质[5-6]，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶产生活性氧（ROS），触发髓过氧化物酶（MPO），MPO刺激中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）从颗粒中易位，NE可促进组蛋白导致质膜通透性增加使NETs释放到细胞外空间。同时NETs的异常激活也会导致自身免疫损伤等[7],并参与自身免疫等相关疾病。文章针对中性粒细胞的激活和NETs释放在疾病中的作用展开讨论，以期为相关研究及应用提供参考。

1 NETs形成分子机制

NETs可杀死细菌，此过程由NETosis触发，目前被认为是一种为坏死的独特程序性死亡，即一种坏死样的中性粒细胞死亡形式。此外，其非溶解性NETosis可在短时间内释放NETs[8]。虽然NETosis与NETs密切相关，但并非所有NETs形成均需要细胞死亡过程。根据细胞死亡命名委员会组织规定，术语“NETosis”应该只适用于细胞死亡，而非基于NETs形成的存在[9]。在金葡萄球菌感染期间的PMN检测到了非溶解性的NETosis，即在非溶解性期间，PMN并未发生死亡。NETosis具有两种机制：经典或细胞死亡途径的NETosis以及非溶解性的NETosis。所有形式及过程均极其相似，但其刺激和最终结果均不相同[10]。

细胞死亡途径的NETosis由各种配体激活TOLL样受体（TLRs）和补体受体（CRs）触发，如佛波酯（PMA），其抗体从内质网中释放Ca的下游信号通路[11]；NETs形成后质膜破裂，导致NETs在数小时内释放到细胞外空间。非溶解性途径NETosis是最近被描述的新途径，依赖革兰氏阴性菌脂多糖（LPS）刺激[12]，导致caspase-4/11的激活以及GSDMD裂解为GSDMD-P30。其中，GSDMD-P30在核膜、颗粒膜和质膜破裂中起到至关重要的作用。NETosis已经被证明可被特异性分子模式激活，如脂多糖（LPS）、TOLL样受体（TLRs）、激活血小板和补体蛋白等。

NETosis形成的主要的生物学步骤包括细胞核膜破裂、染色质逐渐去凝固、NE的转移、组蛋白的加工和合成，最终形成了NETs[13-17]。NETs的形成可通过微生物和内源性刺激促进[18]；同时，NETosis可通过佛波酯（PMA）和白介素8（IL-8）化学刺激物刺激PMN触发[19]。肖敏[20]研究显示，PMA刺激中性粒细胞产生大量ROS，进而引起产生NETs；由缺乏NADPH氧化酶的慢性肉芽肿性疾病（chronic granulomatous disease，CGD）的患者分离出的中性粒细胞经PMA刺激后无法产生NETs，表明NETs的形成依赖NADPH氧化酶催化生成ROS。肺炎链球菌α烯醇化酶（α-enolase）刺激中性粒细胞30 min后即释放NETs，且此过程不产生ROS。因此，不同诱因诱导PMN产生NETs可能存在不同的分子机制。

2 NETs在宿主防御作用

PMN因微生物的影响将形成NETs，NETosis成为一个防御大型微生物的重要途径，在不同的NETsosis刺激物中，NETs结构中防御蛋白的数量也不同。

2.1 NETs的抗菌作用

NETs能够捕获多种细菌并且防止其传播。温丽联[21]研究发现，NETs的成分包含高浓度抗菌蛋白（组蛋白、弹性蛋白酶等）杀伤病原菌和一些颗粒状酶，上述成分在细菌细胞膜的分解中起到至关重要的作用。许多微生物，如链球菌[22]可通过抑制PMN的激活干扰NETosis，使用某种膜覆盖自身而逃避NETs。如金葡萄球菌具有一种特殊的酶[23]，可以将NETs介导模式改变为细胞毒性分子，从而根除免疫细胞。

NETs是一把对抗细菌毒性因子的双刃剑。虽然NETosis可以阻止一些小微生物或含有鞭毛的病原体所引起的感染，但对NETs具有降解因子，从而导致部分含内切酶[24]的病原体引起感染。综上所述，该过程在特定的条件下发生，主要取决于细菌的性质和细菌毒力因子的产生。白色念珠菌通过与补体受体3（cr3）相互作用[25]，参与了脾脏氨酸激酶（SYK）和蛋白激酶C（PKC）信号通路中NOX的激活。此过程促进了NE的易位、ROS产生和自噬，导致NETosis诱导和NETs的传播。

2.2 NETs的抗寄生虫作用

在生物感染寄生虫的过程中，对宿主防御最重要的是免疫细胞，其中包括先天免疫细胞。以弓形虫为例，在感染急性期，PMN起到了关键的保护作用[26]；弓形虫感染成纤维细胞，通过非法入侵的方式破坏细胞膜降低原生动物的活力。细胞松弛蛋白作为一种激动剂蛋白，可阻断寄生虫入侵细胞[27-29]，以利什曼原虫传播为例，PMN通常产生一系列抗菌因子，如一氧化氮、NE和NETs，均具有主要的保护作用[30]。在蠕虫感染的过程中，免疫防御的主要角色包括先天免疫，对免疫的激活至关重要。寄生虫的大小刚好可被PMN或者巨噬细胞（macrophages）所吞噬，但蠕虫体积庞大，无法被吞噬消除[31]。

2.3 NETs的抗病毒作用

虽然目前针对病毒诱导NETs形成机制的相关研究较多，但对NETs抗病毒的免疫尚未完全阐明。NETs的释放是对病毒引起的感染[32]，主要包括艾滋病病毒（HIV）、呼吸道合胞病毒（RSV）和新型冠状病毒（SARS-COV-2）。有研究表明，NETs捕获并且降低了HIV的病毒活性[33]。陆鹏等[34]研究发现，艾滋病严重疾病期，患者接受抗病毒治疗前后PMN减少症与发生机会性感染具有一定关系，PMN上TLR7和TLR8识别病毒核酸，进而产生ROS和MPO衍生的氧化剂，形成NETs并消除艾滋病。

由RSV引起最常见的呼吸道疾病通常发展于幼儿和新生儿[35]，RSV对NETs的形成依赖TLR4、MSRK和ERK的激活，最终通过NOX产生ROS。在呼吸道合胞病毒感染期间，PMN被招募到肺部得以控制感染。因此，RSVF蛋白于PMN上的TLR4结合，触发了NETs的释放，使整个肺部充满了NETs，损害组织功能[36]。

3 展望

近年来，随着NETs的发现，中性粒细胞再次成为研究热点。中性粒细胞通过NETosis的方式投射细胞外陷阱的机制，中和病原体相关分子模式。NETs由细菌、真菌、病毒和寄生虫感染所释放，其释放受病原体的大小及生物毒力等因素影响，NETs通过其内含的抗菌肽和诸多的酶系统进行捕获、抑制和杀灭病原微生物。NETs参与了炎症和多种自身免疫调节疾病的发生发展，但关于NETs的主动调节尚需进一步研究，使之成为一个全新的治疗炎症和自身免疫调节疾病的策略。