早发性卵巢功能不全的颗粒细胞凋亡机制及中医药干预研究进展

汪鸽，韩延华

（黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040）

早发性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）是指女性40 岁之前，由于卵巢功能减退引起的一系列异常表现的临床综合征，主要特征为月经紊乱，包括月经稀发或闭经（4 个月以上），同时伴有促性腺激素升高，连续2 次FSH 水平＞25 U/L（间隔4 周），以及波动性雌激素降低［1］。POI 患者可能会伴随出现血脂异常、血压波动、骨质疏松、心血管疾病及不孕症等，现已成为全球备受关注的问题。既往研究表明，本病发病率约为1%，30 岁前女性发病率为1‰［2］，并呈现逐年上升趋势。中医药在对本病的治疗有较好的临床疗效，因此探讨颗粒细胞凋亡在POI 发生、发展中的机制，以及中医药对POI 的干预作用，具有重要意义。

1 细胞凋亡

细胞凋亡是指在一定的生理或病理条件下，细胞接受机体刺激信号后出现的一种主动的、受凋亡相关基因控制的细胞程序性死亡［3］。这是多细胞生物整个生命过程中不可缺少的环节，对器官组织的生长发育、免疫以及非正常细胞的清除具有重要意义［4］。细胞凋亡有严格的调控机制，以维系各组织器官的发育和稳定，是多细胞生物中一种高度保守的机制，一般由特定因子触发引起，表现出细胞皱缩，随后出现密集的染色质凝结、核碎片、细胞质微泡，最终细胞分裂成凋亡小体，被邻近的细胞或巨噬细胞迅速吞噬和消化［5］。当细胞凋亡机制出现异常时，会引起细胞过度增殖或过度凋亡，从而导致相关疾病的发生［6］。参与凋亡调控和执行的途径及基因产物可能是疾病过程中诊断和治疗干预的优秀靶点。因此，探讨POI 的细胞凋亡机制对其防治有重要作用。

2 卵巢颗粒细胞凋亡诱导POI的内在机制

卵泡发育的各个阶段均有细胞凋亡的发生和参与，其在卵巢疾病的发生、发展中起到了关键作用。卵泡主要由卵母细胞、颗粒细胞和膜细胞组成，其中颗粒细胞是卵巢的基础功能单位，位于卵母细胞透明带外侧，支持卵母细胞生长、发育和成熟，卵母细胞指导颗粒细胞的增殖、分化，参与了卵泡发育、成熟及排卵的整个过程。颗粒细胞在闭锁卵泡中的凋亡早于卵母细胞，是卵泡闭锁的发起者［7］。作为卵巢正常生理功能的重要部分，卵泡闭锁可以清除不正常的组织，然而，一旦颗粒细胞凋亡机制失调，在卵母细胞未成熟的情况下引起大量卵泡闭锁，且闭锁速度快于生理代谢速度时，会过早耗尽卵巢储备［8-9］，进而造成POI。在动物实验中，有学者将卵泡的数目减少、闭锁增多，间质增生，散在慢性炎细胞浸润，卵巢组织萎缩作为卵巢早衰大鼠造模成功依据，而这些大鼠窦前及窦状囊泡数减少，颗粒细胞层明显减少处于凋亡状态［10］。电泳实验显示，在闭锁卵泡的颗粒细胞中分离出的DNA 片段呈梯带图案，这也是细胞凋亡的特征性标志［11］。HUANG 等［12］发现卵巢早衰小鼠卵泡颗粒细胞层紊乱，而干预后能够逆转这些指标，并纠正凋亡相关蛋白表达，由此可见颗粒细胞的异常在POI 的发展中起着关键性作用。而颗粒细胞凋亡也是程序性死亡，由不同的凋亡调控分子活化Caspase 级联，导致凋亡的发生。

目前主要有3 条途径介导颗粒细胞凋亡的发生，分别是死亡受体介导途径、线粒体途径及内质网途径。

2.1 死亡受体介导途径

死亡受体信号转导途径是介导凋亡发生的重要途径之一，又被称为外源性凋亡途径，是指细胞外信号所诱导的凋亡途径，该受体也是肿瘤坏死因子受体（TNFR）家族中的一员。细胞外有富含半胱氨酸的区域，与其配体相结合共同诱导凋亡；细胞内有一名为死亡区域（deathdomain，DD）的结构［13-14］，拥有蛋白水解功能。DD 首先启动死亡信号，并进行传导，最终引发细胞凋亡［15］。在已经发现的众多死亡受体中，具有介导凋亡信号传导功能的主要有3条：Fas/FasL、TNFR和TRAIL。

Fas/FasL 途径：Fas 是细胞表面重要的死亡受体，是跨膜糖蛋白，其配体为FasL，Fas 受到刺激后与其配体相结合，导致3 个Fas 受体分子聚集形成三聚体，使Fas 相关死亡结构域蛋白（FADD）构象发生了变化，激活FADD［16］。FADD 的N 端是死亡效应域（DED），C 末端是DD，DED 与pro-Caspases-8 的DED 相连接［17］，形成了一个重要的诱导凋亡的平台——死亡诱导信号复合体（DISC），激活下游的效应因子Caspase 水解靶蛋白，最终导致细胞凋亡［18］。

TNFR 途径：TNF 主要通过TNFR1 和TNFR2 两种受体介导其发挥生物学效应。TNFR1 表达于几乎所有细胞类型中，其胞内区含有DD，可以引起细胞凋亡，而TNFR2的胞质区不含DD，故无法引起凋亡［19］。TNF通过DD 与TNFR1 结合后，募集衔接蛋白FADD 和TRADD，TRADD、FADD 与pro-Caspase-8 形成DISC，激活pro-Caspase-8，进而激活下游Caspase 活性诱导凋亡的发生［16］。而TNFR2则会通过NF-κB 诱导抗凋亡基因转录［20］。因此TNFR 可能诱导凋亡及抗凋亡两种不同的信号途径，最终结果如何，取决于双方信号水平的强弱及时机的不同［21］。

TRAIL 途径：TRAIL 有两个死亡受体——DR4/5，又称功能型受体，他们的结构类似，其细胞内有传递凋亡信号的DD。TRAIL 可以通过与DR4/5 结合的方式来传递凋亡信号。TRAIL 与表达在细胞膜表面的DRs结合后活化成三聚体，募集FADD［22］。随后FADD通过DED 之间的相互作用结合凋亡起始因子pro-Caspase-8，形成DISC［23］，激活为Caspase-8并通过两种途径来传递死亡信号。一种是外源性凋亡途径，Caspase-8 活化后，可以直接激活下游Caspase 级联反应，启动凋亡执行蛋白酶Caspase-3 促使细胞凋亡。另一种是内源性凋亡途径，需要依赖线粒体来完成凋亡诱导过程，又称线粒体依赖型通路，活化的Caspase-8 切割Bid 为tBid 形式，转移至线粒体内，作用于线粒体膜上，使其通透性增加，释放细胞色素C（Cyt C）和一些凋亡诱导因子到胞浆中，诱导细胞凋亡发生［24］。

综上，Fas/FasL、TNFR和TRAIL 3条途径共同交汇于Caspase-8激活下游因子而发生凋亡。但目前对死亡受体的相关研究尚未成熟，很多内在的机制仍不完善，未来需要对受体信号调节做进一步研究。

2.2 线粒体途径

卵泡的成功发育取决于多种因素，包括受体和激素之间的协调表达、细胞因子刺激、最佳pH 值和充足的能量供应。而线粒体是细胞能量的主要提供者，在细胞凋亡过程中起着重要作用，它可以调节细胞代谢、细胞周期和细胞信号转导［25］。

当机体处于氧化应激状态时，线粒体膜通透性增加，并增加活性氧（ROS）的数量，线粒体功能障碍和氧化应激共同诱导颗粒细胞凋亡［26］。进而使得卵泡发育异常，发生闭锁，进一步发展引起POI。此外作为参与线粒体动力学的最重要蛋白质之一，线粒体融合基因2（mitofusin2，Mfn2）在调节线粒体形态和维持线粒体DNA 稳定性方面起着不可或缺的作用。它是一种位于线粒体外膜的保守的Dynamin 样GTP 酶，通过调节其融合和裂变过程来影响线粒体的结构和功能［27-28］。Mfn2 通过调节其呼吸链，线粒体膜电位以及细胞代谢和细胞凋亡来维持正常的哺乳动物细胞功能［29-30］，因此Mfn2 的较低表达会增加内质网的压力，这可能导致颗粒细胞凋亡［31-32］。Mfn2 在维持线粒体DNA 的完整性中起重要作用，其可能通过线粒体氧化磷酸化影响颗粒细胞的功能。有研究结果显示小鼠组织中Mfn2水平的降低会引起线粒体形态的改变，推测Mfn2 可能使滤泡发育紊乱，从而通过调节线粒体功能和能量代谢，导致POI［33］。研究显示卵巢早衰患者线粒体DNA含量比正常人的低［34］。

2.3 内质网途径

内质网（endoplasmic reticulum，ER）是真核细胞中重要的膜性细胞器，它可以对蛋白质进行处理，同时通过对钙的贮存与释放参与细胞内钙离子浓度的调节。当细胞发生钙离子稳态失衡、氧化应激、蛋白质糖基化修饰过强、感染、炎症等刺激时，内质网腔内未折叠蛋白、错误折叠蛋白增多或钙离子浓度发生变化，从而引起内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）［35］。内质网应激激活未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）是细胞的一种自我保护性措施，能加强内质网处理蛋白质的能力，恢复其稳定状态，从而促进细胞的存活［36］。当ERS 过于强烈和持久，UPR 不能抵抗，内质网稳态不能恢复时，则发生细胞凋亡。其激活细胞凋亡主要表现在两个方面。首先，ERS 主要通过活化CHOP 和JNK 两个重要的中间信号分子传导，最终由Caspase-12执行细胞凋亡命令［37］。其次，细胞通过感应胞浆内高浓度的Ca2+激活钙依赖性蛋白酶，进而诱导凋亡，同时，高浓度Ca2+又可以作用于线粒体使其膜电位改变，释放Cyt C，与胞质中人凋亡蛋白酶活化因子1（Apaf1）结合，进一步激活Caspase-3 和Caspase-7，促进细胞凋亡［38］。

吴玉萍［39］通过建立顺铂诱导POI小鼠模型和体外顺铂刺激卵巢颗粒细胞实验模型，结果显示顺铂可激发颗粒细胞内质网应激，损伤卵巢结构，诱发颗粒细胞凋亡增多而导致POI 的发生，运用内质网应激抑制剂后，颗粒细胞内质网应激得以缓解，颗粒细胞凋亡率降低，最终缓解POI的程度。

3 中医药调控颗粒细胞凋亡治疗POI

随着POI 研究的进一步深入，中医药调节卵巢功能，延缓POI 的内在机制受到越来越多临床工作者的关注，针对单味中药提取物、中药复方及中医其他治法对卵巢颗粒细胞凋亡的调控作用开展了诸多研究，且疗效良好。

3.1 中药单体提取物

李育等［40］观察山茱萸多糖对自然衰老雌性小鼠卵巢功能的改变，发现山茱萸多糖组与空白对照组相比在电镜下可见到各级生长卵泡，颗粒细胞多而厚，线粒体及内质网丰富，证实山茱萸多糖具有抗衰老作用，能够明显改善自然衰老雌性小鼠的卵巢功能。马蔚蓉等［41］采用雷公藤苷灌胃制备POI 小鼠，发现模型小鼠血清抗氧化物SOD、CAT 水平降低，颗粒细胞中的Nrf-2、HO-1 表达降低，ROS 水平上升，提示存在氧化应激。予金丝桃苷治疗后，POI 小鼠卵泡数和黄体数均增加，卵巢病理损伤减轻，血清FSH 水平降低，E2、AMH、SOD、CAT 水平升高，卵巢颗粒细胞中的氧化相关指标（Nrf-2、HO-1）和凋亡相关指标（p-PI3K、p-Akt、Bcl-2）表达上升，氧化相关因子ROS 水平降低，凋亡相关因子Caspase-3 和Bax 表达下降，TUNEL显示细胞凋亡水平降低。提示金丝桃苷具有抗氧化、抗凋亡作用，并通过相关因子来减少POI 小鼠卵巢颗粒细胞凋亡，增加了各级卵泡数，一定程度上修复了卵巢病理损伤，改善了卵巢储备。

3.2 中药复方

王玲［42］通过对经方左归丸的研究发现，左归丸可以通过抑制AZAb 的产生和抑制Fas 介导的卵泡细胞凋亡使自身免疫性POF 模型小鼠的Bcl-2 增加，FaL降低，细胞凋亡率明显下降，从而改善小鼠卵巢及免疫功能。刘慧萍等［43］研究显示，补肾活血方组（熟地黄、山茱萸、紫石英、补骨脂、菟丝子、生地黄、桑寄生、乌药、鸡内金、泽泻、土鳖虫、覆盆子、路路通、泽兰、桔梗、水蛭和甘草）小鼠Fas mRNA 表达水平明显低于模型组。补肾活血方通过抑制Fas、FasL 基因的表达和提高E2，降低LH、FSH 的水平，从而改善卵泡颗粒细胞的凋亡达到治疗作用。张丽娟等［44］研究了二仙汤对顺铂所致模型组小鼠的影响，灌胃后二仙汤组BXA 蛋白表达量减少，Bcl-2蛋白表达增加，凋亡的卵泡颗粒细胞减少，E2含量升高，说明二仙汤可通过抑制顺铂减轻卵巢颗粒细胞凋亡，改变E2与FSH 含量，促进卵泡生长，促进卵巢功能的恢复。谭贝加等［45］研究发现，宁心红杞胶囊能够增加卵泡颗粒细胞中线粒体和滑面内质网数量，并改善其形态，改善颗粒细胞功能，延缓卵巢衰老。

3.3 中医其他疗法

卢岩等［46］运用卢氏隔药灸脐法治疗POI 大鼠，大鼠卵巢Bcl-2 蛋白和mRNA 表达显著升高，Bax 蛋白和mRNA 表达明显降低，提示隔药灸脐可以通过抑制卵泡颗粒细胞的凋亡来改善卵巢功能。曹俊红针刺大鼠肾俞、足三里和三阴交穴治疗围绝经期大鼠，与未接受针刺的大鼠对比发现，针刺治疗后大鼠卵巢颗粒细胞Fas mRNA 表达明显降低，而Bcl-2 mRNA 表达明显提高［47］。郑艳华等［48］发现低频电针能够降低大鼠卵巢组织中Bax/Bcl-2 比值，卵巢染色切片发现接受针刺的大鼠卵巢可见多个黄体存在，囊性卵泡减少，颗粒细胞层明显增厚，推测针灸可能是通过线粒体途径和死亡受体途径抑制卵巢细胞凋亡，改善卵巢微环境，从而延缓卵巢早衰的进程。

综上可见，中医药对POI 的治疗均以补肾为基本原则，肾藏精，主生殖，为先天之本，元气之根，肾气盛则天癸至，月事来潮，肾为卵巢功能盛衰、月经行止、卵泡发育的主导，故选用补肾填精之中药和腧穴。研究中亦发现，补肾能提高免疫功能，增加卵巢血流，改善卵巢微环境，提升卵巢功能，促进卵泡发育。故补肾益精是促卵泡发育，治疗POI的根本大法。

4 展望

近年来对POI机制的研究不断深入，已经证实POI与凋亡、自噬、氧化应激等机制相关，目前激素替代疗法（HRT）是经典的治疗方案，但激素治疗会增加乳腺癌、血栓性疾病和肝肾代谢异常等风险。越来越多实验研究证明中医药在改善卵巢功能方面有着较好的效果，体现了中医药多途径、多靶点的作用特点［49］。本文介绍了介导卵巢颗粒细胞凋亡导致POI 的3 种途径及中医药通过抑制凋亡分子降低颗粒细胞凋亡率，改善卵巢功能的作用，可以为POI 的防治提供思路。补肾贯穿治疗本病之始终，符合现代中医妇科通过调整肾-天癸-冲任-胞宫生殖轴的理论思想，能够改善卵巢功能，提高卵子质量，促进卵泡发育成熟，为临床治疗POI提供了更多的可能性。但目前研究领域主要停留在细胞因子的相关研究上，加大中医药与凋亡机制的研究，将是未来研究的重点和方向［50］，这对治疗POI、改善相关症状、提高生育率都有十分重要的意义。