实验性自身免疫性葡萄膜炎的中医药干预研究进展

王琦妙，张远龙，庞雅菊

(天津市眼科医院/天津市眼科学与视觉科学重点实验室，天津 300020)

葡萄膜炎是一类严重致盲的眼病，自身免疫是其主要致病原因之一，因其难治、病程久、反复发作等特点，一直以来困扰着患者及医生。实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis,EAU)是研究人类自身免疫性葡萄膜炎的实验动物模型，通过用视网膜抗原在易感动物中诱导，临床特征明显、可重复性好，易于追踪研究与指标量化，是药物干预治疗评估的理想模型[1-2]。国内外研究中，有对相关细胞因子在EAU发病机制中作用的研究[3-5]。有对EAU发病特征的研究[6]，有对治疗方法及新制剂开发的研究等[7-8]。中医药在调节免疫功能治疗葡萄膜炎方面有着独特的优势，且中医药干预葡萄膜炎的实验研究也一直在进行，现将中医药干预EAU的研究综述如下。

1 单药干预

中药成分复杂，为了更好地研究其对自身免疫性葡萄膜炎的作用，学者从中提取有效成分进行实验研究，观察其治疗效果，并进一步探讨作用机制。

雷公藤内酯醇(triptolide,TP)又称雷公藤甲素，是从雷公藤、昆明山海棠等物质中提取的一种环氧二萜内酯化合物，具有抗炎和免疫抑制作用[9]。有实验研究，在以0.1 mg/(kg·d)(腹膜内)TP干预EAU小鼠，发现连续用TP 28 d小鼠与用环孢素霉A免疫抑制作用相当，而这种免疫抑制作用在免疫后14～28 d用TP干预的小鼠中明显下降。用药28 d的小鼠引流淋巴结和炎症眼中Th1型细胞因子(IL-12p40、IFN-γ和TNF-α)的K2特异性淋巴细胞增殖和mRNA表达均降低。考虑TP可通过下调Th1型应答对EAU实现抑制作用[10]。

白杨素多是从木蝴蝶中提取的一种天然黄酮类化合物，具有抗炎作用且无毒。孟祥达等[11]对白杨素治疗EAU及机制进行探讨，对白杨素组小鼠自免疫前3 d至免疫后21 d按25 mg/kg的剂量每日给予白杨素灌胃，发现服用白杨素小鼠视网膜炎症评分降低，玻璃体及视网膜炎性细胞浸润减轻，说明白杨素可保护视网膜组织免受炎症细胞破坏。TUNEL法对视网膜细胞凋亡情况评估，显示白杨素不能促进视网膜细胞凋亡，故认为白杨素对EAU的治疗作用不是通过促进炎细胞凋亡途径实现。进一步检测视网膜Th1和Th17细胞分泌的炎性因子及转录因子表达量，结果显示白杨素可抑制JAK-STAT途径激活因子IFN-γ、TNF-α、IL-6的表达，抑制STAT1、STAT3的磷酸化，从而抑制Th1、Th17细胞分泌IFN-γ、IL-17A。证明白杨素对EAU的治疗作用机制可能与抑制STAT途径的激活有关。

火把花根片又称昆明山海棠，主要由生物碱类、萜类、皂苷、内酯等成分组成，具有抗炎、免疫调节等作用。研究显示，火把花根可能通过抑制树突状细胞分泌TNF-α和IL-6及淋巴细胞增殖来发挥预防和治疗EAU的作用[12]。

白芍总苷(total glucosides of peony,TGP)是芍药根中提取的一类糖苷类物质，具有抑制自身免疫反应、止痛、抗炎及免疫调节的功效，在自身免疫疾病中应用广泛。景常莹等[13]使用TGP干预EAU进行实验研究，在造模后3～28 d给予大鼠3 mL/100 g TGP溶剂灌胃，TGP干预组大鼠眼部炎症情况明显低于模型组，免疫后7 d、12 d、21 d、28 d每组随机处死3只大鼠，对肝脏细胞研究发现TGP可能通过刺激自然杀伤细胞发挥抗炎作用，减轻EAU；也可促进IL-4分泌，减少IFN-γ的分泌，加速EAU炎症的消退。

2 复方内治

自身免疫性葡萄膜炎多病因不明确，临床表现多变、病程演变复杂，西医治疗药物多为非甾体抗炎药、糖皮质激素、免疫抑制剂及生物制剂，这些药物在治疗的同时给身体带来的不良反应也较严重。于是中药对自身免疫性葡萄膜炎的优势就凸显出来，而在此类研究中，中药经典及经验复方制剂的治疗占多数。

清开灵是在名方“安宫牛黄丸”基础上开发的复方制剂，清热解毒化湿，祛痰通络开窍，可促进组织细胞代谢，有抗炎免疫作用。有研究对实验性葡萄膜炎兔眼炎症评分，并于造模后1，3，7，10，14天对房水及外周血中IL-2、TNF-α含量进行测量，显示清开灵具有改善兔实验性葡萄膜炎的临床体征，抑制房水和外周血IL-2、TNF-α的作用[14]。

近年来，几个研究团队用新制柴连汤、祛风活血丸、龙胆泻肝汤对EAU的治疗进行了较详细的研究。

张智军教授团队用新制柴连汤加减对兔EAU模型血清细胞因子IL-12、IL-17、IFN-γ的影响进行研究，以地塞米松作为对照，并分为中药大剂量组和中药小剂量组干预治疗，观察实验动物炎症反应并测定细胞因子含量，发现新制柴连汤可减轻实验兔葡萄膜炎炎症，中药大剂量组与对照组在减轻炎症方面作用相当，但对照组复发率高。中药大剂量组可降低兔血清IL-12、IL-17、IFN-γ水平，实验兔葡萄膜炎的严重程度与IL-12 浓度高低可能呈正相关性；中药大剂量组抑制血清中IL-17效果良好，小剂量组抑制作用欠佳；中药对IFN-γ的调节呈一定的量效关系，以上可能是新制柴连汤治疗葡萄膜炎机制[15-17]。

喻京生教授团队用祛风活血丸对EAU大鼠的干预进行系列研究[18-19]。祛风活血丸由熟地黄、当归、川芎等8味中药组成，具有祛风清热、养血活血功效。研究以祛风活血丸对EAU鼠灌胃治疗，测量血清炎性因子IL-35与IL-10、IL-15与IFN-γ的表达，发现祛风活血丸能够减轻鼠 EAU 的发病并加速眼部炎症消退，其机制可能是通过调节IL-35与IL-10的活性及浓度，抑制促炎因子表达及促抗炎性因子的分化与表达的双重功能发挥抗炎作用。IFN-γ影响正常机体的生理平衡和自身免疫的稳定，在正常眼内无明显表达，在葡萄膜炎眼组织中可明确检测到；IL-15可促进IFN-γ分泌，抑制调节性T细胞的凋亡，结果显示祛风活血丸能抑制IL-15、IFN-γ的表达，改善EAU病理过程。进一步通过检测血清Fas、Fasl的表达及视网膜组织中Bcl-2 mRNA、Bax mRNA、Caspase-3蛋白的表达量研究中药干预EAU的机制与细胞凋亡有关[20-21]。喻京生等[22]取EAU大鼠视网膜组织做免疫组化，通过不同组别干预及表达量的研究发现祛风活血丸能通过调节TGF-β2的状态，对EAU发挥治疗作用。实时荧光定量核酸扩增(real-time quautitative PCR,qRCR)法对EAU大鼠视网膜组织中IL-17 mRNA、IL-23 mRNA和RORγt mRNA相对表达量进行检测，显示祛风活血丸可能通过抑制葡萄膜炎性Th17相关炎症因子IL-17 mRNA、IL-23 mRNA和RORγt mRNA的表达来发挥抗炎作用[23]。同样用qRCR法对大鼠视网膜组织中miRNA-155、miRNA-146a和miRNA-182的相对表达量检测，发现祛风活血丸能抑制miRNA-155、miRNA-146a表达，促进miRNA-182表达，从而考虑其可通过影响以上三种RNA的表达调控EAU的进程，并推测这3种RNA可能作为潜在的治疗葡萄膜炎药物的作用靶点[24]。还对视网膜组织中JAK2、STAT3 mRNA的表达量进行测量，结果祛风活血丸大剂量组JAK2、STAT3 mRNA表达均降低，考虑JAK2、STAT3 mRNA为祛风活血丸干预EAU的又一作用靶点，可通过调控JAK2/STAT3信号通路，达到抗炎作用[25]。

毕宏升教授团队对龙胆泻肝汤干预EAU的治疗作用进行研究。龙胆泻肝汤(longdan xiegan decoction,LXD)主要泻肝胆实火，具有免疫调控作用。检测EAU大鼠治疗前后血液、淋巴结及脾脏中IFN-γ、TNF-α、IL-10、IL-17的变化，发现LXD能通过抑制IFN-γ、TNF-α、IL-17相关炎症因子的表达发挥抗炎作用，促进IL-10的表达，加速自身免疫炎症的恢复[26]。治疗前后检测大鼠房水蛋白及血清中的白蛋白、球蛋白的变化，发现LXD组房水蛋白浓度明显低于模型组；组织病理学观察，模型组视网膜结构破坏程度高于LXD组，故认为LXD能减轻EAU大鼠前房炎症细胞浸润，保护眼部组织结构，调节眼部免疫状态[27]。以上在体实验已证实LXD治疗葡萄膜炎有效，进一步利用网络药理学数据和生物信息学的方法探讨LXD分子机制，网络药理学分析显示LXD治疗葡萄膜炎，主要通过MAPK信号通路、促性腺激素信号通路和雌激素信号通路，减少炎症因子的产生和细胞浸润，调节机体免疫状况，调控葡萄膜炎的发生发展[28]。Notch信号通路也是调节炎症反应和自身免疫疾病的重要通路。研究证实Th17/Treg比例失调与Notch表达升高有关[29]。刘滨等[30]发现EAU大鼠脾脏和淋巴结中Notch1、Notch2、Notch4蛋白表达水平在LXD干预后显著降低。殷学伟等[31]研究LXD对EAU大鼠Notch信号通路活化的抑制作用及对Th17/Treg表达水平的影响，发现LXD能下调EAU大鼠脾脏、淋巴结、眼组织中Notch1、DLL4分子表达，抑制Notch信号通路活化，降低IL-10和IL-17 mRNA及蛋白的表达水平，调节Th17/Treg比例平衡，促进全身及眼内免疫平衡。在对各组别EAU大鼠血清中C4、MBL2蛋白表达水平及脾脏和淋巴结CD4+/CD8+细胞比例进行检测，显示LXD可有效调整CD4+/CD8+细胞比例，降低血清C4蛋白表达，上调MBL2蛋白表达水平，从而促进补体系统平衡的恢复，加快葡萄膜炎的改善[32]。

3 外用药物

EAU模型从机制上讲，病变主要累及眼后节，以Lewis大鼠造模的EAU模型会出现较严重的眼前节炎症。对这类模型进行外用中药滴眼剂干预也有明显的疗效。

研究者从昆明山海棠中提取生物碱制备不同浓度雷公藤总生物碱滴眼液，以典必殊滴眼液作为对照，于免疫后9 d开始点眼，每6 h 1次。每3 d各组取2只大鼠4只眼球行常规切片和HE染色，通过对眼前节炎症评分和病理组织学观察，发现0.05%雷公藤总生物碱滴眼液可有效抑制大鼠EAU眼病理改变，与典必殊滴眼液治疗无明显差异[33]。

田庆梅等[34]观察清开灵眼用凝胶对EAU的治疗作用，免疫后第7天开始点眼，每日3次，连续用药7 d。通过对眼部炎症反应评分及组织病理学的观察，清开灵组可减轻大鼠EAU炎症，但较妥布霉素地塞米松组效果略差。对大鼠脾脏淋巴结CD4+、CD8+值及Th1、Th17细胞比进行测定，考虑清开灵减轻炎症反应的机制主要是抑制CD4+细胞的增生和分化，CD4+/CD8+降低，Th1、Th17效应细胞分化被抑制，减少相应炎性细胞因子分泌。

4 穴位埋线法

有研究证实，针灸对慢性炎症性疾病有双向调节作用。穴位埋线是在传统针灸及穴位注射基础上改进，用特制的针具把可吸收的羊肠线埋入穴位，产生生物化学反应，从而发挥免疫调节作用[35]。

郝小波教授团队对穴位埋线干预EAU大鼠进行研究，穴位埋线于造模后第2天进行，依据大鼠穴位图谱选择脾俞(第12胸椎下两旁)、肋间(左右侧各一穴)、肾俞(第2腰椎下两旁，左右侧各一穴) 进行埋线操作，穴位埋线组与模型组炎症反应均在造模后13 d达到高峰，穴位埋线组炎症评分低于模型组，且差异有统计学意义。组织病理学显示，在第9，13，18，23天虹膜、睫状体、视网膜炎症模型组均比穴位埋线组严重；采集大鼠心脏血液并分离淋巴结中T淋巴细胞，流式细胞仪分析，第13天CD4+T细胞占比最高，CD8+T细胞占比最低[35-36]。对造模后第9，13，18，23天大鼠心脏血中IFN-γ、IL-4 mRNA的表达量进行检测，发现穴位埋线可在炎症期提升以IL-4为代表的炎症保护因子的分泌，抑制以IFN-γ为代表的炎症保护因子，从而减轻炎症反应，纠正Th1/Th2失衡[37]。

5 小 结

自身免疫性葡萄膜炎为CD4+T细胞所介导，大量实验表明葡萄膜炎主要原因是机体产生了针对自身抗原特异性的T淋巴细胞，主要包括Th1、Th2、Th17细胞亚群。中医药治疗葡萄膜炎优势在于毒副作用少、复发率低，现代药理学研究发现不少中药具有免疫调节作用，EAU动物模型的成熟，为中医药治疗葡萄膜炎实验研究奠定了基础。从葡萄膜炎自身免疫性疾病特点出发，发挥中医药特色，对治疗机制进行深入探讨，主要体现在对Th1、Th17细胞的独立或协同抑制作用，对Th2细胞的保护作用及Treg细胞的介导抑制作用。立足于中医药学基本理论，应用现代实验学科研技术开发中医药资源宝库，已成为中医药发展的重要目标。