液体活检在恶性肿瘤中的应用

王红兵

癌症是一个全球性的主要公共卫生问题[1]。2020年全球癌症新报告和死亡病例一半来自中国[2]。我国社会人口老龄化的进程，成为近年来癌症负担增加的主要驱动因素[3]。液体活检，以衍生于肿瘤部位的CTCs、循环游离DNA或RNA、外泌体等为标志物，从患者体液提取、分析的统称，正在兴起，并发挥作用于肿瘤诊断的早期应用，确诊后管理，风险评估，转移或复发监测[4～7]。CTCs和ctDNA在液体活检领域应用较早，已有商业化项目获准应用于临床实践。exosomes虽起步晚，但与CTCs和ctDNA相比，具有丰度高、来源广、半衰期长的特点，成为液体活检研究的新宠，近年来取得了不错的进展。本文将以CTCs、ctDNA和exosomes为代表，对其分离、检测方法以及在临床上的应用等进展进行综述。

1 液体活检生物标志物概述及检测技术

1.1 循环肿瘤细胞(CTCs)

1.1.1概述 1869年病理学家Ashworth在癌症死亡患者血液中发现，有一类细胞，其形态与肿瘤形态相似，将其命名为CTCs。CTCs是一种从实体肿瘤病灶，包含原发和转移病灶，自发脱落或受手术操作、活检取材等外界刺激而被动脱落，以游离的单个细胞或多个细胞聚集的细胞团状态，进入外周血液系统，并循环至全身的肿瘤细胞[4～6,8，9]。极少数CTCs在血液中存活，充当种子，传播到远处，完成转移过程。已在许多不同的上皮细胞癌(肺癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌和前列腺癌)和不表达上皮来源标志物的癌症(多形性胶质母细胞瘤和黑细胞瘤)[4～6，8]被证实。CTCs携带了完整的来源于母体瘤的遗传学信息，包含基因组、蛋白组等生物信息，可据此为信息源研究肿瘤组织，在癌症的早诊、疗效观察、转移或复发监测等方面发挥重要作用，为患者提供精准医疗依据，个体化治疗指导[4～6]。CTCs还可作为细胞培养株，进行体外培养，作为药敏试验，早期预测不同类型癌症的治疗反应[5]。

1.1.2检测技术 CTCs在进入外周血后，绝大多数会被免疫系统识别而清除，只有极少数能够存活，血液中CTCs含量极低[8]。对CTCs进行检测、分析的前提，是寻找效率高、特异性强、灵敏度好、细胞活性优的捕获、富集、分离技术。不同的血细胞，均有其独特的物理、生物特性，目前常用的方法均是据此而设计开发[4～6,8～10]。物理法有基于细胞大小的微孔滤膜过滤法、基于细胞密度的密度梯度离心法、基于电荷的凝胶电泳法。生物法根据抗原抗体特异性反应，依靠细胞表明不同的标志物和粘附分子，基于免疫磁珠、微流控芯片技术等进行针对性筛选，筛选出肿瘤细胞的为阳性富集，去除掉非肿瘤细胞的为阴性富集，有代表性的技术平台为CellSearchTM、MagSweeperTM、CTC-Chip、nanotube-CTC-chip、CellCollectorTM等。CellSearch系统是一种体外富集系统，于2004年获美国FDA授权，用于乳腺癌、前列腺癌和直肠癌的诊疗。CellCollector系统是一种新兴技术，首创CTCs体内捕获方式，2012年获得CE认证、2017年获得CFDA三类认证，可用于肺癌、前列腺癌、乳腺癌等。富集完成后，可采用荧光标记技术结合免疫、核酸检测技术，如免疫荧光、荧光原位杂交、流式细胞术、荧光定量PCR等，以及近年来兴起的液滴数字PCR(Droplet Digital PCR，dd-PCR)和高通量测序技术(NGS)等对CTCs进行细胞形态、功能亚群、蛋白组学和基因组学分析和检测[4～6,8～10]。近年来，有学者研究发现，通过整合单细胞RNA测序与CTCs分析，可识别癌基因的点突变和拷贝数变异等，能更好的证明CTCs的异质性，并据此识别癌症亚型，进一步揭示癌症转归的分子机制，预测肿瘤表型转化和耐药，为患者提供真正个体化治疗指导[5，9]。

1.2 循环肿瘤DNA(ctDNA)

1.2.1概述 在体液环境中，包括血液、脑脊液、尿液等，可检测到一类游离的DNA片段，被称为循环游离DNA(cell-free DNA，cfDNA)。研究发现，cfDNA起源于肿瘤微环境的肿瘤和非肿瘤细胞，以及来自其他身体部位的细胞[10,11]。肿瘤细胞来源的cfDNA为ctDNA[11]。ctDNA携带的遗传信息，与其母体细胞一致，可通过对ctDNA点突变、缺失/插入、甲基化修饰、拷贝数异常等的检测，观察其母体肿瘤基因缺陷和表观遗传学改变[4～6，11]，为肿瘤诊断、微小残留病灶(Minimal Residnal Disease，MRD)、预后分析、转移监测等提供重要信息[4～6，11，12]。ctDNA中值半衰期为35分钟，其丰度与肿瘤负荷呈正相关，可实时提示肿瘤进展[12]。

1.2.2检测技术 ctDNA在cfDNA含量很低，不到1%，从血液中提取足够数量的ctDNA是保证检测质量的前提。目前主要使用商品化的试剂盒来提ctDNA，利用磁珠法和微柱离心法来吸附、洗脱、分离、纯化ctDNA。ctDNA的检测基于识别肿瘤特异性畸变或cfDNA 样本中的表观遗传标记，有高灵敏度检测预先指定的癌症相关突变的超灵敏靶向方法，基于PCR技术的dd-PCR、磁珠乳液扩增技术、等位基因特异性PCR 、等位基因特异性不可延伸引物封闭 PCR、低温共扩增 、肽核酸锁定核酸PCR、甲基化特异性PCR和基于测序技术，如标记扩增深度测序技术、癌症个体化深度测序分析(cancer personalized profiling by deep sequencing, CAPP-Seq)；有无偏倚地检测基因组畸变的非靶向方法，全基因组测序(WGS)、全外显子组测序(WES)、FastSeqS和NGS等[4～6,11]。dd-PCR因可实现核酸绝对定量，结果更加可靠，已成为近年来的研究热点。

1.3 外泌体

1.3.1概述 外泌体是表面呈凹半球状的类囊泡小体，具有立体膜结构，直径约40～100 nm[13]。外泌体来源广泛，可由大多数细胞(免疫和非免疫)分泌，包括树突状细胞、淋巴细胞、肥大细胞和肿瘤细胞，广泛存在于各种体液环境，具有脂质双膜，携带大量母体细胞信息，包括蛋白质、脂质、核酸(DNA/RNA)等,参与许多生理、病理过程[14,15]。肿瘤微环境可提升外泌体的异质性，改变外泌体大小及内容物的功能，促进外泌体释放，不同的癌症衍生的外泌体差异很大。肿瘤来源外泌体携带肿瘤特征性信息，包括微RNA、长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)、信使RNA、环形RNA(circular RNA，circRNA)、DNA、蛋白质等，介导肿瘤细胞间通讯、参与调节肿瘤微环境、促进肿瘤生长、转移等，展示出了在肿瘤诊断、预后、监测、转移方面潜在的应用前景[14,15]。

1.3.2检测技术 外泌体的分离、提取是鉴定、研究、应用最关键的步骤，目前的提取方法主要是基于密度、体积、分子表型等，有离心法(包括高速离心法、密度梯度离心法)、沉淀法、膜亲和法、免疫磁珠法、超滤膜过滤法、尺寸排阻色谱法、适配体法、微流控芯片技术、商业试剂提取等[4，13～15]。提取后的检测，则是根据所要检测的靶目标，选择有针对性的检测方法。针对外泌体形状和颗粒表征，电子显微技术(扫描、投射电镜和原子力显微镜)可展示表面形态信息，动态光散射可用于测量外泌体大小和 zeta 电位分布，纳米颗粒跟踪分析可用于确定颗粒浓度和尺寸分布；针对外泌体蛋白质，选用酶联免疫吸附试验、蛋白印迹、流式细胞术、色谱分析、质谱分析等；针对外泌体RNA和DNA，选用实时荧光定量PCR、数字PCR、NGS测序等方法；针对外泌体脂质，常用质谱分析技术[4，14，15]。新兴跨学科技术的发展，为外泌体的分离和检测提供了新的思路和手段。学者们开发出了基于脂质分离、声学隔离以及热泳富集等新的分离方法，基于分子信标、DNA四面体探针、生物传感器、热泳传感器、CRISPR/Cas系统辅助检测和人工智能等新的检测方法[7]。

2 液体活检在临床上的应用进展

2.1 肿瘤预警及早期诊断液体活检因技术灵敏度高，选用的生物标志物往往在肿瘤早期即可表现出异常，早于影像学改变及传统的肿瘤标志物，可用于健康和高危人群肿瘤的预警及早期筛查。Cohen等[16]描述了一种通过血液检测8种常见恶性肿瘤(肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、结肠直肠癌和食道癌)的方法，称为CancerSEEK。该方法结合8种蛋白标志物与ctDNA分析16个基因中的相关突变，对1005例临床诊断的前述8类非转移性癌症患者检测，特异性≥99%，整体中位敏感性约70%，展示了ctDNA作为肿瘤早期诊断生物标志物的应用前景。Chen等[17]选择了10个外泌体circRNA，通过实时定量逆转录PCR(qRT-PCR)筛选，分析比较肺腺癌(lung adenocarcinoma，LAUD)组和健康对照组血浆浓度，发现circ_0000690、circ_0001346、circ_0001439和circ_0001492在病例组的表达水平，在病程早期就已上调表达，circ_0001346和circ_0001492在对照组几乎检测不到，意味着circ_0001346和circ_0001492可作为LAUD早期诊断候选标志物。Wang等[18]研究发现，与健康对照组相比，外泌体circ_002178在LAUD组表达显著增加(AUC0.9956，P<0.001)；且在病例组中，来源于肿瘤细胞的外泌体circ_002178表达明显高于正常人支气管上皮细胞来源的外泌体；这些结果证实了血清circ_002178作为LAUD新的诊断标志物的可能性。Shi[19]等通过qRT-PCR技术，以分化拮抗非蛋白编码RNA(differentiation antagonizing non-protein coding RNA，DANCR)为检测目标，以乳腺癌、良性乳腺疾患和健康女性为目标人群，分析比较血清外泌体 lncRNA DANCR水平，发现血清外泌体 lncRNA DANCR 是一个乳腺癌独立的风险因素，与传统标志物CA153、CEA联合使用更是能大大提高诊断准确率。Li等[20]设计、实施了一项多中心前瞻性研究，以食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)患者和健康志愿者为队列，包括试点队列(ESCC 患者、对照各3例)和发现队列(ESCC患者、对照各33例)，对唾液外泌体进行 RNA 测序来鉴定tRNA 衍生的小 RNA (tsRNAs)，发现，tRNA-GlyGCC-5和一种以前未鉴定的小RNA(因来源于ESCC 患者唾液的外泌体中，被命名为sRESE)组成的双标记，能够以高灵敏度 (90.50%) 和特异性 (94.20%) 区分ESCC患者与对照组，进一步展示了外泌体作为生物标志物，在肿瘤诊断方面的可行性和应用前景。

2.2 肿瘤疗效观察及预后评估液体活检技术因创伤小、取材方便、患者配合度和依从性较高，可以反复、规律性取材，有助于指导用药、适时观察疗效和评估预后，实现肿瘤的精准化治疗。 Heller等[21]对比转移性去势抵抗性前列腺癌 (metastatic castration-resistant prostate cancer，mCRPC)患者对比前列腺特异性抗原(PSA)和CTC0，对五项随机三期临床试验进行了综合分析，呈现的结果表明，使用 FDA 批准的 CellSearch 测定其定义的 CTC0 终点，CTCs 数量从可检测(存在)到不可检测(不存在)，是一种反应指示生物标志物，与更长的生存期密切相关，与PSA相比，这是一个明确的让患者受益的早期临床指标。Lorente等[22]研究表明，对接受COU-AA-301(阿比特龙或安慰剂+强的松)和 IMMC-38(化疗)的晚期前列腺癌患者，在治疗前12周，CTCs数量的增加意味着更差的预后。 Goldberg等[23]通过对接受抑制剂治疗的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者的ctDNA研究，发现 ctDNA 响应，定义为ctDNA 水平下降低于基线值的一半，和射线照相响应之间有很强的一致性，且 ctDNA反应明显早于射线照相反应，达到 ctDNA 反应的患者有更长的治疗受益时间，以及优越的无进展生存期和总生存期。Sandfeld-Paulsen等[24]通过细胞外囊泡阵列技术，以外泌体膜表面49 种蛋白质为目标，用49种抗体对其进行可视化捕获，对276 名 NSCLC 患者血浆外泌体分析表型，研究评估外泌体蛋白质表型作为 NSCLC 的预后生物标志物，发现 NY-ESO-1与预后显示出了较强的关联性，证明NY-ESO-1是一种强有力的NSCLC的预后生物标志物。Gauthier等[25]进行了一项前瞻性试点研究，以探索CTCs预测新辅助化疗口咽癌患者预后，发现CTCs阳性变异的患者总生存期较低，表明可早期识别患者CTCs数量的变化，及早调整治疗策略，提高生存率，同时限制不必要的治疗副作用。

2.3 肿瘤MRD和复发监测MRD是描述在治疗期间或治疗后留在体内的极少数癌细胞的术语。这些残留的癌细胞可导致肿瘤复发和转移，却无法通过影像学或临床检查检测，只有采用灵敏度足够高的实验室方法，才能从海量正常细胞中检测到这些癌细胞[6]。测序技术和生物传感器的发展，显示出了液体活检在MRD 检测方面可喜的成果，故可应用液体活检技术监测MRD，用于疗效观察和复发监测。Chaudhuri等[26]通过深度测序 (CAPP-seq) 进行个性化分析，以40例接受 I～III 期治疗的局限性肺癌患者、54例对照的ctDNA为样本(共计255份)，在可评估的复发患者中，多达94%的患者可在治疗后的第一次检测点检测到ctDNA；在治疗后可检测到ctDNA 的患者均观察到了不良结果，早于影像学进展。Hellmann等[27]对31例从PD-(L)1 阻断剂治疗中获得长期益处(无进展生存期≥12个月)的晚期 NSCLC 患者，从治疗期间/治疗后的监测时间点，通过CAPP-Seq分析 ctDNA，发现几乎所有在监测中检测不到 ctDNA 的患者保持无进展，检测到ctDNA 的患者最终均取得了进展。Garcia-Murillas等[28]进行了一项前瞻性研究，以55例接受新辅助化疗的早期乳腺癌患者为队列，在完成治愈性治疗后，单次术后时间点或随访期连续检测血浆ctDNA，以评估转移性复发风险，证实ctDNA分析可以定义MRD，更准确地预测复发。Tie等[29]在一次前瞻性研究中，对230例手术切除的II期结肠癌患者，术后第一次随访时检测ctDNA，ctDNA阴性组中90%达到了3年无复发生存，ctDNA阳性组则为0%。在上尿路尿路上皮癌(upper tract urothelial carcinoma，UTUC)，Nakano等[30]2021年最新的研究也证实了ctDNA 可用于检测 UTUC 患者根治性手术后的 MRD。

3 展望

目前肿瘤诊断的金标准仍是组织活检。但传统活检需要从肿瘤部位提取组织标本，存在感染和内出血的风险，患者体验性差。液体活检，作为一种改进性诊断和监测方案，从患者血液和其他体液提取生物标志物，无创或微创，可灵敏、方便地提供具体、准确的分子信息，逐渐受到越来越多的关注。液体活检的生物标志物，可提供连续的基因突变信息，更好地反应肿瘤时间和空间上的异质性，包括侵袭性和整体分子景观，用于肿瘤诊断、预后、MRD和转移监测等，并通过过早的介入和及时调整治疗，提高癌症患者的总体生存率。

尽管液体活检在癌症的早诊、预后和监测转移方面，已证明了其无与伦比的优越性，代表了一种前景良好的诊断和监测方案，但大规模的临床应用仍面对不少挑战。CTCs在外周血中丰度低、形态各异、异质性强，目前单一的捕获技术均存在一定的缺点，双模态捕获技术尚不成熟，还在研究之中。ctDNA在外周血中含量特别少，只能提示肿瘤负荷，无法确定肿瘤分期、定位。Exosomes的提取缺乏标准、快速、易行的方法，不同的方法有其独到之处和各自的缺陷，尚缺乏能同时保证数量和质量的方法。高灵敏的检测方法，会产生一定的偏好性和假阳性。这些均限制了液体活检在临床上的应用。不过，相信随着技术的进一步发展，对癌症病理机制的进一步认识，新的共识将不断达成，液体活检规范化、标准化的分离、提取和分析方法必将不断建立；同时，随着大量的多中心和前瞻性的临床研究的开展，液体活检的临床有效性和实用性必将获得进一步认可。