三子养亲汤调节哮喘大鼠气道线粒体自噬相关基因BECN1 UVRAG的实验研究

张博达 谢 芳 全亚林 张 燕 刘 梦 蒲珊珊

资料显示，目前全球哮喘患者达3.58亿，大多数国家哮喘的发生率不断上升[1]。2019年中国肺健康研究显示，20岁以上哮喘患者4570万，发生率为4.2%[2]。气道重构是哮喘的重要病理生理特点，但长期以来一直无特殊治疗手段[3～5]。

中医药以痰治哮在临床取得较好疗效[6]。现代医学认为哮喘患者均发生气道重构，主要特征是纤维化、基膜增厚、杯状细胞化生、黏液分泌增加，并介导气道高反应性和可逆气道阻塞，此认识与中医宿痰伏肺理论同源异流[7～9]。肺组织中线粒体的生理功能除了生产能量还产生活性氧(reactive oxygen species，ROS)，ROS又能够引起线粒体的损伤，线粒体的损伤关系到细胞的生存[10]。畸形线粒体在哮喘患者的气道平滑肌细胞和肺上皮细胞中很常见，提示线粒体功能和生物状态受到干扰[11]。现有研究表明自噬是哮喘气道重构的关键驱动因素[12]。故线粒体功能异常广义上符合中医脾为气血生化之源，虚生痰，痰贮肺成哮的理论。

笔者前期研究发现，三子养亲汤有改善气道炎症状态的作用，而炎症与自噬、气道重构密切相关[13]。本研究拟观察三子养亲汤对哮喘大鼠气道线粒体自噬的影响，并探讨其内在的分子机制。

材料与方法

1. 实验动物：3～5周鼠龄的Wistar大鼠共35只，体质量60～80g。实验动物购自成都达硕动物实验有限公司，实验动物许可证号：SCXK(川)2018-25。动物饲养于川北医学院实验动物中心，维持12h昼夜节律，室温25℃，相对湿度50%～70%，自由进食、饮水。

2.药品与试剂：三子养亲汤：莱菔子12g、白芥子12g、紫苏子12g，实验药物购自川北医学院附属医院中药房，由四川省中药材公司统一煎煮、浓缩，所有流程均符合《中国药典》标准；发动蛋白抑制剂(mitochondrial division inhibitor, Mdivi-1)(批号：20200507)，规格：10mg，购自美国Selleck公司；OVA(批号：A5708)购自美国Sigma公司；UVRAG，Beclin1蛋白定量分析试剂盒(批号：Br52155648，Dx5856612)购自上海江莱生物科技有限公司；实时荧光定量PCR试剂盒购自武汉博士德生物技术公司。

3.主要实验仪器：倒置生物显微镜(CKX-31)购自日本奥林巴斯公司；超临界萃取仪(SFT-1000)购自美国SFT公司；酶标仪(Multlskan Mk3)购自赛默飞世尔仪器有限公司；透射电子显微镜(HT7700)购自美国HITACHI公司；NanoUV-3000 型微量核酸蛋白检测仪购自广州标旗光电科技有限公司；ABI7500 Real- time PCR仪购自赛默飞世尔仪器有限公司。

4.动物分组及造模：35只Wistar大鼠按随机数字表法分为5组，分别为空白组、哮喘模型组、三子养亲汤组、三子养亲汤+Mdivi-1组和Mdivi-1组，每组7只。哮喘大鼠模型采用腹腔注射卵蛋白加雾化激发复制。分别于第1天和第14天腹腔注射0.1%卵蛋白加氢氧化铝凝胶混合液(二者比例为1∶4，pH值7.4)。15～28天在自制玻璃箱中雾化吸入2%卵蛋白NaCl注射液 5ml。每天1次，每次持续30min，连续激发14天[14]。

5.给药：每天在激发前0.5h，按人和大鼠间体表面积折算等效剂量，对三子养亲汤组大鼠灌胃浓度5.4g/(kg·d)中药汤剂2ml；Mdivi-1组大鼠用1.2mg/(kg·d)药量2ml灌胃，三子养亲汤+Mdivi-1组使用10.8g/(kg·d)和2.4mg/(kg·d)各1ml先后灌胃；哮喘模型组使用0.9%NaCl注射液2ml灌胃，连续2周。

6.电镜观察线粒体自噬体：取绿豆大小的肺组织团块，于丙酮上脱水，将样品插入包埋板过夜，切60～80nm超薄切片，铀铅双染色，干燥过夜，透射电子显微镜下观察，采集图像分析。

7.肺组织中UVRAG、Beclin1含量检测：处死大鼠，剪开胸腔，将实验大鼠左肺小心剥离，取100～200mg肺组织，加入Ripa裂解液，冰上孵育30min匀浆，12000r/m离心10min，取上清液，按试剂盒要求采用 BCA 法进行蛋白定量，以β-actin为内参，采用Image J软件进行图像分析，计算上述蛋白的变化。

8.HE及PAS形态学观察：大鼠处死后，肺组织标本以10%甲醛溶液固定，以苏木精-伊红(HE) 及过碘酸-Schiff 染色，并做病理切片，观察肺组织的形态变化。

9.UVRAG、Beclin1 mRNA q-PCR 检测：大鼠肺组织提取总RNA，采取Trizol试剂纯化并制备cDNA，并按Thermo Fisher Scientific SuperScript Ⅳ反转录试剂盒说明操作，所得结果用2-ΔΔCT法分析。引物序列: 从美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)中搜索基因序列，使用Primer引物设计软件筛选各基因特异性引物。所有引物均交由武汉博士德工程技术服务有限公司设计合成并纯化。引物序列详见表1。

表1 引物序列(5′→3′)

结 果

1.大鼠一般情况观察：除正常组外，哮喘模型组大鼠出现呼吸急促、不停挠鼻、喷嚏、腹肌抽搐、动作迟缓、精神状态差、摄食饮水量较正常组下降等典型哮喘症状。三子养亲汤组大鼠精神较好，呼吸平稳，自主运动无异常。依据大鼠症状提示，哮喘模型复制成功。Mdivi-1组与三子养亲汤+Mdivi-1组大鼠表现与哮喘模型组比较，差异无统计学意义。

2.三子养亲汤对哮喘大鼠肺组织中Beclin1、UVRAG含量影响：Western blot法检测大鼠肺组织，与空白组比较，哮喘模型组大鼠Beclin1、UVRAG指标显著升高。经药物干预后，三子养亲汤组Beclin1、UVRAG指标明显下降，详见图1。

图1 三子养亲汤对哮喘大鼠肺组织Beclin1、UVRAG蛋白表达影响

3.三子养亲汤对哮喘大鼠UVRAG、Beclin1 mRNA 含量影响：Real- time PCR检测大鼠肺组织中UVRAG、Beclin1 mRNA 含量，与空白组比较，哮喘模型组大鼠Beclin1、UVRAG mRNA 指标显著升高。经药物干预后，三子养亲汤组Beclin1、UVRAG mRNA指标明显下降，详见图2。

图2 三子养亲汤对哮喘大鼠肺组织Beclin1、UVRAG mRNA表达影响

4.三子养亲汤对哮喘大鼠肺组织病理学影响：HE染色结果显示,空白组支气管无明显改变，未见明显的杯状细胞增殖(图3A)。哮喘模型组支气管炎，支气管周围可见大量的炎性细胞浸润，肌层损伤断裂，炎症浸润至黏膜层，支气管上皮细胞化生大量杯状细胞(红色箭头)，少量的支气管上皮组织脱落(黄色箭头，图3B)。三子养亲汤组肺泡内少许气道上皮(黄色箭头)，基膜无明显增殖(黑色箭头,图3C)。三子养亲汤+Mdivi-1组少见支气管上皮脱落(黑色箭头)，局部肺泡扩张(红色箭头)，基膜增厚，肺泡腔内多见零散的巨噬细胞(黄色箭头,图3D)。Mdivi-1组一侧肺泡壁轻度增厚，并伴有的炎性细胞浸润(黑色箭头)，一侧肺泡重度扩张，肺泡壁断裂(红色箭头,图3E)。

图3 三子养亲汤对哮喘大鼠肺组织病理学影响 (HE染色，×200)

PAS染色结果显示，空白组支气管未见明显的杯状细胞增生，未见明显其他异常(图4A)。哮喘模型组大量的杯状细胞增生(黑色箭头)，少量的支气管上皮组织脱落(红色箭头，图4B)。三子养亲汤组支气管上皮组织脱落(黑色箭头)，少量杯状细胞增生(红色箭头，图4C)。三子养亲汤+Mdivi-1组大量的杯状细胞增生(黑色箭头)，并伴有小黏液栓形成(红色箭头,图4D)。Mdivi-1组大量的杯状细胞增生(黑色箭头)，内含未分泌黏液(红色箭头,图4E)。

图4 三子养亲汤对哮喘大鼠肺组织病理学影响(PAS染色， ×200)

5.三子养亲汤对哮喘大鼠肺组织线粒体自噬形态学影响：空白组细胞表面见微绒毛结构，细胞内见丰富的嗜锇性板层体，未见自噬体(图5A)。哮喘模型组嗜锇性板层小体结构破坏，板层结构疏松，见较多自噬体，线粒体肿大明显(图5B)。三子养亲汤组细胞内线粒体结构基本正常，见较少自噬体形成(图5C)。三子养亲汤+Mdivi-1组细胞内未见自噬体，线粒体肿大变形(图5D)。Mdivi-1组细胞内未见自噬体，线粒体肿胀呈低电子密度(图5D)。

图5 三子养亲汤对哮喘大鼠肺组织线粒体自噬形态学影响 (透射电镜，×8000)

讨 论

哮喘反复发作，缠绵难愈，究其根本，原是哮有“宿根”所致。《证因脉治》云：“哮病之因，痰饮留伏，结成巢臼，潜伏于内”阐明了哮与痰之间的因果关系[15]。中医理论认为，脾主运化，为气血生化之源，后天之本，脾气亏虚，水运失常，痰浊内生；中焦气机受阻，肺通调水道失常，贮肺为痰。三子养亲汤源于《韩氏医通》，具有降气、消食、化痰之功。其中苏子降气行痰、止咳平喘；白芥子温肺利气、快隔消痰；莱菔子消食导滞、行气祛痰。三者合用治疗咳喘气逆、痰多胸痞、食少难消，舌苔白腻，脉细滑等症， 以消为补可明显减少肺痰致哮的发生概率[16,17]。

已有研究证实，UVRAG是体内至关重要的自噬调节剂，促进自噬可能有助于防治易感人群的炎症性疾病和癌症[18]。Kim 等[19]通过研究发现mTORC1磷酸化UVRAG可以负调控自噬体和内体成熟。Beclin1可以通过CCD和ECD结构域与ClassⅢ PI3K结合，形成Beclin1-ClassⅢ PI3K-Vps15 复合体，上调细胞自噬水平[20]。UVRAG能与 Beclin1 的 CCD 结构域结合，提高 Beclin1与ClassⅢ PI3K 的相互作用以及 ClassⅢ PI3K 的活性，从而上调细胞自噬的水平，故选择UVRAG和Beclin1作为线粒体自噬状态的标志物[21]。

本研究通过肺组织形态学观察显示，三子养亲汤可减轻哮喘大鼠肺组织杯状细胞化生，抑制气道基膜增厚，这种改善作用可被线粒体自噬抑制剂Mdivi-1阻断，电镜观察显示使用自噬抑制剂后线粒体自噬体消失，提示三子养亲汤发挥作用跟调控线粒体自噬有关。各哮喘实验组Beclin1mRNA 表达变化趋势与Beclin1蛋白一致，且三子养亲汤组与模型组比较差异有统计学意义，提示三子养亲汤可能通过对Beclin1转录水平调控而发挥相关作用。Beclin1上游因子UVRAG蛋白测试中发现三子养亲汤+Mdivi-1组抑制作用最强，具有协同作用，但UVRAG mRNA检测显示，哮喘模型组与三子养亲汤+Mdivi-1组比较UVRAG mRNA差异明显，且趋势与UVRAG蛋白达不一致，提示三子养亲汤可能通过调控UVRAG mRNA转录后环节而起作用。

综上所述，三子养亲汤能改善哮喘大鼠气道重构，与其下调Beclin1、UVRAG表达恢复线粒体自噬有关，其作用的具体靶点可能是UVRAG mRNA的转录后环节。