SEC1基因敲除对实验性结肠炎小鼠严重程度和肠道菌群的影响

胡定元 徐拓宇 徐 缘 朱浩奇 李盛村 蒋 益 吴 昊

炎症性肠病(inflammatory bowel diseases, IBD)是一组病因不明的慢性肠道非特异性炎症性疾病，主要包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)和克罗恩病(Crohn′s disease, CD)。近20年来该病在我国的发生率呈逐年增高趋势[1]。目前认为IBD是免疫、环境、炎症等因素综合作用于遗传易感者，使其发生针对自身肠道菌群的异常免疫应答，最终出现难以控制的肠道炎性反应。研究发现，HLA-B27转基因大鼠或IL-10-/-小鼠均会产生自发性结肠炎，但是在肠道无菌环境下则不会发生肠道炎症，这提示肠道菌群是IBD发病的重要环节[2,3]。

岩藻糖基转移酶(fucosyltransferase，FUT)2基因主要负责编码α-(1,2)-岩藻糖基转移酶[4]。国内外研究已经发现FUT2基因是CD的易感基因[5～8]。另有研究显示，小鼠肠道上皮细胞FUT2基因条件性敲除后，小鼠结肠炎症显著加重，并发现肠道菌群组成和功能的变化可能参与其机制[9]。在小鼠中，α-(1,2)-岩藻糖基转移酶主要由FUT2基因、FUT1基因和SEC1(secretory blood group 1)基因表达，本研究拟探讨SEC1基因敲除对实验性结肠炎小鼠炎症和肠道菌群的影响。

材料与方法

1.实验动物：采用CRISPR/Cas9基因敲除技术获得SEC1-/-C57BL/6品系小鼠(赛业生物科技有限公司)，经PCR验证SEC1-/-小鼠基因型后，在无特定病原体(SPF)环境中饲养、繁殖，选择6～8周龄，体质量20～22g的SEC1-/-雌鼠和野生型(wild-type, WT) C57BL/6品系小鼠作为实验对象。实验动物许可证号：SYXK(浙)2018-0017。

2.主要试剂：葡聚糖硫酸钠(dextran sulphate sodium，DSS)(相对分子质量36～50kDa)购自美国MP Biomedicals公司，苏木精染液由南京建成生物工程研究所提供，伊红染液由上海碧云天生物技术有限公司提供。肠道菌群DNA由美国Omega E.Z.N.A.®细菌DNA试剂盒提取。采用德国Leica倒置显微镜分析病理切片。16s-rDNA测序平台为美国illumina MiSeq 测序系统。

3.实验性结肠炎模型构建：SEC1-/-小鼠和WT小鼠共同饲养1周后，分为SEC1-/-结肠炎组(n=14)、WT结肠炎组(n=15)和健康对照组(n=6)共3组。前两组结肠炎小鼠均给予3%(w/v)DSS自由饮用造模5天，诱导急性实验性结肠炎模型，而对照组小鼠给予普通饮用水。

4. 结肠炎严重程度评估：结肠炎造模开始后，每日记录各组小鼠大便性状、便血情况、精神状况和体质量变化，按照Hartmann等制定的评分标准评估小鼠结肠炎疾病活动指数(disease activity index, DAI)。造模后第7天采用颈椎脱臼法使小鼠安乐死，迅速剖取结肠，收集各小鼠升结肠内粪便标本，然后用预冷0.9%NaCl溶液冲洗结肠，取末端结肠1cm，固定在4%多聚甲醛中，用作苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining，HE染色)，观察结肠组织病理。

5. 16s-rDNA肠道菌群分析：收集各小鼠升结肠内粪便标本(其中SEC1-/-结肠炎小鼠组和WT结肠炎小鼠各随机选取6只)后，置于-80℃冰箱冻存备用。提取结肠内粪便标本DNA后，进行PCR扩增： 16s-rDNA V4区PCR扩增引物序列：515-正向引物：GTGCCAGCMGCCGCGGTAA，806-反向引物：GGACTACHVGGGTWTCTAAT。总反应体系50μl，包含30ng DNA样本，25μl PCR预混液和4μl PCR引物混合物，引物终浓度为0.08μmol/L。PCR反应条件：98℃变性3min；98℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，共30个循环；72℃延伸7min，最后置于4℃保存。PCR产物经纯化后，采用MiSeq PE250测序。

结 果

1.SEC1基因敲除对结肠炎小鼠严重程度的影响：饮用DSS后，WT小鼠和SEC1-/-小鼠均逐渐出现腹泻、便血症状等疾病活动表现，体质量较对照组显著下降(P<0.05)。SEC1-/-结肠炎小鼠较早出现腹泻、便血症状，饮用DSS第5天开始，其疾病活动指数较WT结肠炎小鼠升高更加明显(P均<0.05，图1)。饮用DSS第6天开始，与WT结肠炎小鼠比较，SEC1-/-结肠炎小鼠体质量下降更加显著(P<0.05，图2)。饮用DSS第7天，与WT结肠炎组比较，SEC1-/-结肠炎小鼠体质量显著下降(87.0%±6.2% vs 77.9%±4.7%，P<0.05)，而疾病活动指数显著升高(7.3±2.8 vs 9.4±2.6，P<0.05)。进一步分析比较肠组织黏膜病理发现，SEC1-/-结肠炎小鼠的结肠黏膜上皮受损、隐窝结构破坏和炎性细胞浸润较WT结肠炎小鼠更加明显(图3)。

图1 SEC1基因敲除对DSS诱导的结肠炎小鼠DAI的影响

图2 SEC1基因敲除对DSS诱导的小鼠结肠炎体质量变化的影响

图3 野生型结肠炎和SEC1基因敲除结肠炎小鼠肠道病理(HE染色)

2.DSS结肠炎造模对小鼠肠道菌群的影响：DSS结肠炎小鼠的OTU个数与对照组比较，差异无统计学意义(194 vs 207，P>0.05，图4)。虽然两组的Shannon和chao1指数比较，差异无统计学意义(P>0.05)，但DSS结肠炎小鼠Simpson指数显著低于对照组(0.83 vs 0.91，P<0.05)，提示DSS结肠炎造模后小鼠肠道菌群alpha多样性降低。DSS结肠炎造模后，在菌门分类中，厚壁菌门和脱硫杆菌门减少，而变形菌门和疣微菌门增加；在菌属分类中，Akkermansia属和大肠杆菌-志贺菌属增加，而毛螺菌科属和梭状芽孢杆菌属减少(P均<0.05)。

3.SEC1基因敲除与结肠炎小鼠肠道菌群组成的相关性：SEC1-/-结肠炎小鼠肠道OTU个数较WT结肠炎小鼠显著增多(305 vs 194，P<0.05，图4)。SEC1基因敲除后，结肠炎小鼠肠道菌群的Shannon和chao1指数也显著增加(4.71 vs 4.09；332 vs 207；P均<0.05)，提示菌群多样性显著增加。PCA分析表明，SEC1-/-结肠炎小鼠和WT结肠炎小鼠肠道菌群组成比较，差异有统计学意义(图5)。通过菌群丰度比较发现，两组小鼠之间某些细菌在各个分类水平的相对丰度比较，差异均有统计学意义。在门分类水平，SEC1-/-结肠炎小鼠肠道中厚壁菌门(平均丰度值55.25 vs 16.38)、拟杆菌门(0.02 vs 0.002)、巴氏杆菌门(1.82 vs 0.09)、放线菌门(1.60 vs 0.80)、蓝藻菌门(0.10 vs 0.02)和硝化螺菌门(0.02 vs 0.01)的丰度增加，而变形菌门(0.81 vs 27.35)、脱硫杆菌门(0.55 vs 1.74)、弯曲杆菌门(0.76 vs 2.64)和疣微菌门(24.95 vs 33.72)的丰度降低(P均<0.05，图6)；在属分类水平，乳酸杆菌属(平均丰度值28.95 vs 2.23)、梭菌属(0.13 vs 0.01)和糖单胞菌属(1.82 vs 0.09)显著增多，而拟杆菌属(0.12 vs 1.64)、大肠杆菌-志贺菌属(0.15 vs 22.87)和幽门螺杆菌属(0.76 vs 2.64)均显著减少(P均<0.05，图7)。进一步功能预测分析显示，这些差异表达的菌群与多种菌群功能相关，包括糖酵解Ⅲ、8-氨基-7-氧杂壬酸酯生物合成I、乙炔降解、饱和脂肪酸延长等(P均<0.05)。其中，SEC1敲除后结肠炎小鼠中参与岩藻糖降解的菌群丰度显著减少(P<0.05)。

图4 小鼠肠道菌群OTUs比较

图5 小鼠肠道菌群组成的主成分分析

图6 小鼠肠道菌群在菌门分类层面组成的堆积条形图

图7 小鼠肠道菌群在菌属分类层面组成的堆积条形图

讨 论

肠道菌群失衡可能是IBD发病的关键环节。临床研究显示，IBD患者肠道中拟杆菌门、厚壁菌门和双歧杆菌显著减少，而大肠杆明显增加[10]。肠道菌群参与调节肠黏膜辅助性T(T-helper, Th)-17细胞和调节性T细胞(regulatory T cell, Treg)的比例，而Th17/Treg细胞失衡被公认是IBD发病的重要机制之一[11]。本研究发现与对照组小鼠比较，WT结肠炎小鼠肠道菌群Simpson指数显著降低，提示肠道菌群α多样性减少，这也提示肠道菌群组成变化可能与实验性结肠炎密切相关。

岩藻糖基化修饰普遍存在于肠道上皮细胞表面的蛋白质，在宿主微生物共生中具有重要作用[12]。肠腔中的岩藻糖也具有调控菌群定植作用[13]。有研究已经表明，岩藻糖基化缺乏能诱发结肠炎，而补充岩藻糖乳糖则能改变肠道菌群组成并缓解结肠炎[14～17]。结肠炎小鼠服用L-岩藻糖后，结肠炎病情得以缓解，其机制可能是调节M1型巨噬细胞极化以及下调促炎性细胞因子表达[16]。国内有研究者也发现外源性L-岩藻糖能缓解DSS诱导的实验性结肠炎，并能抑制小鼠M1巨噬细胞极化、NLRP3炎性小体和NF-κB信号通路[16]。对慢性结肠炎小鼠的研究还发现，岩藻糖能通过恢复肠道胆汁酸水平和肠道菌群组成缓解结肠炎[18]。另有研究进一步证实，肠道菌群是L-岩藻糖改善结肠炎症的关键环节[19]。

小鼠SEC1基因又称FUT3、FUT10基因，是小鼠体内3种表达α-(1,2)-岩藻糖基转移酶的基因之一。在小鼠肠道中，α-(1,2)-岩藻糖基转移酶主要由FUT2基因表达[20]。Lin等[21]研究发现，给予无菌小鼠定植菌群后，小鼠小肠中FUT2基因表达显著增加，而FUT1和SEC1基因无明显变化。FUT2基因在小鼠和人类中的研究较为广泛，但是SEC1基因较少受到关注。

本研究发现，SEC1基因敲除后，DSS诱导的结肠炎小鼠严重程度加重。这与Tang等[9]基于FUT2基因敲除小鼠的研究相似。研究发现条件性敲除小鼠肠道上皮细胞FUT2基因后，DSS诱导的结肠炎小鼠肠道炎症显著加重、肠道黏膜屏障破坏更加明显。尽管有研究提示SEC1在小鼠肠道中表达量和活性极低，本研究发现SEC1基因敲除还影响结肠炎小鼠的肠道菌群组成，使肠道菌群OTU个数增加，α多样性和β多样性均增加，且影响各个分类水平细菌的相对丰度[21]。例如，在门分类水平，SEC1基因敲除结肠炎小鼠肠道中厚壁菌门、拟杆菌门、巴氏杆菌门、放线菌门、蓝藻菌门和硝化螺菌门的丰度增多，而变形菌门、脱硫杆菌门、弯曲杆菌门和疣微菌门的丰度降低。菌群功能预测分析发现，这些菌群差异与糖代谢等多种功能相关，其中包括岩藻糖降解。这提示SEC1基因仍可能通过某种机制影响肠道菌群组成，从而进一步影响小鼠结肠炎症。

综上所述，本研究发现SEC1基因敲除能加重DSS诱导的结肠炎小鼠严重程度，并影响结肠炎小鼠的肠道菌群组成。然而，其具体机制仍不明确，有待于开展后续研究予以进一步证实。