针灸内关穴预处理改善心肌缺血再灌注损伤机制的研究进展

杨琪琪,刘珍珍,张小蕾,黄 伟△

(1.湖北中医药大学,湖北 武汉 430061；2.针灸治未病湖北省协同创新中心,湖北 武汉 430061)

急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)是由于冠状动脉急性缺血、缺氧所引起的一种心血管系统的急危重症，多发于中老年人，严重威胁着人们的生命。近年来，由于人口老龄化的加剧、膳食结构的改变、吸烟和日常锻炼的减少等原因使得其发病率逐年攀高。流行病学资料显示，AMI已上升为全球死亡和残疾的主要原因[1]。目前，溶栓疗法、经皮冠脉介入疗法(PCI)和冠状动脉旁路搭桥术(CABG)等再灌注疗法为临床上公认改善AMI患者预后的有效措施。然而，血流供应重新恢复后反而会造成心肌超微结构、功能、代谢及电生理方面的进一步损害，甚至诱发不可逆损伤，这种现象被称为心肌缺血再灌注损伤(Myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)[2]。据报道，世界范围内每年有近90万人因此出现围手术期心肌梗死、心力衰竭和心源性猝死等心血管事件,其死亡率高达10%～15%[3]。目前对于MIRI的防治主要侧重药物治疗，但由于大多数药物的治疗靶点单一以及不可避免的副作用，使得越来越多的人们开始探索非药物治疗策略。

针灸疗法具有操作简便、副作用低以及多靶点、多环节和多途径等优势，近年来受到人们广泛重视。已有研究证明针灸预处理能使机体产生适度应激，启动机体内源性适应机制从而预防或减轻随后疾病的损伤[4]。内关穴为手厥阴心包经之络穴，自古以来可用于治疗各种心胸疾患，大量临床及动物实验研究证实内关穴与心脏之间有着特异性的联系，并在MIRI的防治中显示出积极的作用。因此，近年来应用各种针灸内关预处理方法防治MIRI以及探究其如何发挥心肌保护作用已成为当今医学界的关注热点。本研究就针灸内关预处理抗MIRI的保护作用机制研究进行阐述，为临床采用针灸内关预处理防治本病提供思路。

1 抑制氧化应激

氧化应激是机体代谢、免疫和生长发育等多种信号途径的启动者和参与者。生理条件下，氧化应激反应对于清理老化细胞和异常细胞、维持内环境稳定性具有积极作用；缺血再灌注时，氧自由基(OFR)大量释放且超出了生物体内的抗氧化能力，引起机体的氧化损伤[5]。同时OFR攻击膜成分中的不饱和脂肪酸，分泌脂质过氧化产物，并损伤线粒体、内质网等亚细胞器膜结构，进一步加重MIRI。陈松等[6]证实电针内关预处理具有较强的抗氧化及清除活性氧(ROS)的能力，可以显著增加氧自由基清除酶——超氧化物歧化酶(SOD)活性，降低乳酸脱氢酶(LDH)、过氧化产物丙二醛(MDA)等氧化应激损伤标志物水平，进而保护心肌细胞免受氧化作用。Nrf2为调节氧化应激反应的重要因子，一方面，氧化应激可促进Nrf2 mRNA转录，提高Nrf2的蛋白表达；另一方面，机体受到上游信号刺激时，Nrf2与抗氧化反应元件ARE相结合，启动内源性抗氧化应答机制，并上调相关抗氧化酶基因的表达，从而对抗氧化应激对心肌细胞的损害[7]。邵明璐等[8]发现，针刺内关预处理后，血清SOD活性、Nrf2基因表达下调，而MDA含量和HO-1基因表达增加，心肌细胞损害减轻。提示针刺内关预处理可以激活Nrf2-ARE内源性抗氧化通路，对抗氧化应激以减轻心肌缺血再灌注损伤。

2 减轻炎性反应

炎性细胞因子可直接或间接参与心肌缺血/再灌注损伤的炎症过程,刺激炎症的产生。MIRI初始阶段，中性粒细胞被激活，进而发生聚集和浸润，释放大量促炎因子和炎症介质，如白介素IL-6、IL-1β及肿瘤坏死因子(TNF-α)等，扩大炎性反应[9]，造成血管功能障碍及组织损伤。此外，炎症反应所诱导的细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)的广泛表达，反过来又加重损伤血管内皮。韩永丽等[10-11]发现电针内关预处理可以抑制MIRI大鼠模型中ICAM-1和VCAM-1的表达，并减少(TNF)-α、IL-1β的释放，激活内源性抗炎因子，减轻炎性细胞的浸润，从而保护心肌免受炎性损伤。朱怡等[12]研究发现，电针内关预处理还可降低MIRI大鼠“内关”穴区Toll样受体4(TLR4)、髓样分化因子88(MyD88)及核转录因子-κB(NF-κB)基因表达。TLR4及其介导的信号通路是重要的炎症损伤途径，而NF-κB能够活化炎性细胞因子，因此抑制TLR4信号传导、降低NF-κB有效表达能够缩小心肌细胞的炎症反应。此外，研究显示[13]，对MIRI大鼠进行电针内关预处理后，其各项心功能指标(LVDd、LVDs、FSEY及LVEF)均有不同程度的改善，而心肌高迁移率族蛋白1(HMGB1)的表达显著减少。结果证实内关预处理对心肌确有保护作用，其机制可能与HMGB1蛋白被抑制有关。HMGB1作为致炎细胞因子调节区域的重要因子，具有促进炎性因子释放以及活化AMPK通路的作用，其参与了心肌缺血再灌注的炎症损伤过程。

3 抑制细胞凋亡

心肌细胞损伤的主要形式以及最终结局是细胞凋亡。目前，MIRI所介导心肌细胞凋亡信号转导通路主要集中在死亡受体途径、线粒体途径以及内质网途径。死亡受体通路涉及结合死亡受体配体(Fas-L)到促炎受体上，促进死亡领域的适配器蛋白FADD的聚集，完成死亡诱导的信号复合体，激活膜受体死亡信号，从而水解细胞蛋白加速细胞凋亡[14]。林海波等[15]发现电针及艾灸内关穴预处理能有效降低MIRI兔中死亡受体通路Fas/Fas-L蛋白的表达，减轻心肌缺血损伤时细胞凋亡，并对心肌细胞发挥48 h的延迟相保护作用。同时，热休克蛋白70(HSP70)可以干扰应激导致的死亡受体通路的活化，阻断该途径引起的凋亡[16]。王超等[17]研究不同时间窗(0 h、24 h和48 h)介入电针或艾灸预处理对MIRI兔的心肌保护作用。结果显示不同时间窗内关预处理均可以抑制血浆中内皮素(ET)和血清CK活性升高，上调心肌HSP70蛋白表达，进而减轻MIRI。其机制可能与凋亡途径抑制蛋白上调有关，从而发挥心肌细胞的保护作用。此外，该实验表明针刺对MIRI的保护效应具有时间差异，且这种保护效应表现为艾灸强于电针，后效应强于即刻效应，可为临床针灸介入时间及方式提供初步实验依据。

线粒体通路激活可以使线粒体通透性转换孔(MPTP)持续开放，膜通透性增加，使细胞质内促凋亡蛋白Bax进入线粒体与抗凋亡蛋白Bcl-2结合，阻止Bcl-2的激活，从而诱导细胞凋亡[18]。李芳等[19]研究证实，内关预处理可以上调bcl-2、下调Bax的蛋白表达，从而阻碍线粒体介导的细胞凋亡程序。内质网应激(ERS)可激活下游凋亡因子，发动细胞凋亡。再灌注损伤早期，ERS启动CHOP的转录和表达，后期通过激活Caspase-12扩大细胞凋亡作用，加重心肌的损害。朱建刚等[20]证实，针灸内关预处理可以下调内质网相关蛋白GRP78、Caspase-12及Chop的表达，从而减轻ERS以发挥心肌保护作用，并进一步发现其机制可能与Akt通路激活相关。

4 调控自噬

自噬是生物体内一种维持细胞自身稳态的调控机制，但当再灌注时期，自噬与凋亡通过Bcl-2发生干扰，导致自噬过度激活，从而加速心肌细胞死亡[21]。Beclin-1是自噬小体形成以及自噬进程中一个关键的蛋白调节因子，其表达上调直接参与了再灌注期间的自噬激活。而自噬相关蛋白1(ULK1)是参与心肌缺血阶段调节自噬的主要因子,二者均对自噬起到关键调控作用[22]。陈婉莹等[23]探讨电针或艾灸内关穴预处理对MIRI大鼠心肌的自噬调节作用，证实内关预处理可以下调ULK1和Beclin1的表达，从而抑制细胞过度自噬和凋亡。谭成富等[24]进一步发现，电针、艾灸内关预处理所产生的适度自噬调控作用与自噬相关蛋白LC3Ⅱ表达减少相关。

5 改善内皮功能

心肌缺血时，冠状动脉内皮出现损伤，血管内皮细胞被激活以及黏附分子分泌增加，促使白细胞黏附并产生大量活性氧，加重心肌损伤的程度。同时，ROS导致的脂质过氧化会促进血管收缩物质的分泌增加，抑制血管松弛因子的分泌，导致冠脉收缩，使冠脉血流发生障碍[25]。NO是人体内皮细胞合成的重要血管活性物质之一，具有强大的疏通血管、维持血管张力的功能。NOS为含铁的单氧化酶，可催化左旋精氨酸转化为胍氨酸和NO[26]。刘卫星等[27]探讨不同时相(0.5 h、1.5 h和3 h)温针灸预处理对MIRI大鼠的血管活性物质的影响。发现温针灸预处理可以上调血管活性物质(NO、NOS)，有效缩小梗死面积，从而保护缺血心肌，且这种心肌改善程度显示出明显的时间依赖性。宋瑾等[28]从穴位特异性角度探讨电针预处理对MIRI的保护作用，发现电针内关穴预处理可以改善内皮细胞分泌功能抗缺血再灌注损伤，并强调了内关与心脏的特异性联系。相关研究[29]进一步证实，内关预处理对血管活性物质的增强作用可能与Akt/eNOS通路激活相关。此外，有研究[30]发现降钙素基因相关肽(CGRP)的表达在I/R前后会发生改变，MIRI所引起的应激反应会使CGRP浓度过高，导致血管的过度扩张，加重心肌的再灌注损伤。林亚平等[31]研究发现，电针内关预处理可以降低血浆CGRP含量，阻止再灌注应激反应的发生，参与缺血心肌的保护，其中高频组的作用优于低频组。

6 减轻钙超载

心肌缺血再灌注时期，钙动态平衡失调，导致Ca2+大量内流蓄积形成细胞内钙超载，进而诱发心肌细胞酸中毒或线粒体功能障碍，是心肌损伤的的重要环节[32]。钙网蛋白(CRT)在钙超载的损伤中具有正向调控作用，CRT过度表达可抑制肾上皮细胞内质网Ca2+释放，减轻心肌细胞内钙超载[33]。田岳凤等[34]研究证实针刺内关预处理可有效上调CRT mRNA的表达率，从而改善钙超载，维持心肌细胞活力。

7 调节中枢神经作用

多年来针灸研究趋近于一个推论，针灸通过神经-内分泌-免疫网络发挥扶正祛邪、防病保健作用，其中中枢神经占主导地位[35]。延髓头端腹外侧区(RVLM)是整合中枢交感活动最重要的部位，也是心脏、血管等活动的关键调节中枢[36]。阿片肽、5-羟色胺(5-HT)是RVLM中的一类神经递质，通过激活阿片受体和5-HT受体可以抑制交感神经紧张性，阻碍心肌缺血伤害性刺激冲动的传入，增强心脏对应激的耐受，从而发挥心肌保护作用。陈楚陶等[37]早期实验证实针刺内关预处理可以有效降低5-HT的阳性表达，减轻MIRI。钟敏等[38]研究发现，与对照组相比，电针内关预适应可以减轻心肌损伤的程度，但是应用阿片受体阻断剂后该保护作用迅速被抑制，提示阿片受体介导了电针预适应改善心肌缺血性损害的作用。李万山等[39]进一步从基因角度证实电针内关穴可提高κ阿片受体(DOR)mRNA的表达率，以调节机体内源性阿片系统，从而对远端心脏发挥保护效应。

下丘脑是调节内脏活动和内分泌活动的较高级神经中枢所在，参与体内电解质与体液平衡及心血管活动的调节。下丘脑β3-肾上腺素能受体(β3-ADR)与心肌密切相关，可作为一种心脏负性肌力指标，心肌缺血缺氧时β3-ADR表达增加，促使心脏功能恶化[40]。林亚平等[41]研究针刺内关预处理对MIRI大鼠下丘脑内β3-ADR阳性表达的影响，发现β3-ADR在神经通路中起着信号传导的作用，电针内关预处理可通过降低β3-ADR含量，阻止MI/R伤害性神经信号的传递过程，从而发挥心肌保护效应。另外，有研究表明[42]下丘脑室旁核(PVN)作为心血管活动的关键核团，其介导了内关预处理抗心肌缺血的神经保护效应。李梦等[43]进一步证实，对MIRI大鼠进行电针内关预处理后，其脊髓背根神经电活动明显下调，下丘脑室旁核DA和NE浓度升高，提示内关预处理抗MIRI的神经源性机制与PVN内单胺类神经递质可能相关。

8 调节能量代谢

能量代谢是心肌细胞活动的物质基础。心肌缺血时心肌氧供减少，以无氧代谢为主，可引起细胞内酸中毒，致使胞浆内钙超载，损伤心肌组织；同时，能量代谢障碍可引起心肌细胞基因结构和表达的异常，诱导凋亡发生[44]。心肌利用能量的代谢形式是ATP，其来源以葡萄糖和游离脂肪酸为主。糖原耗竭或乳酸堆积会导致心肌收缩功能严重受损，而脂肪酸代谢产物可直接损害细胞膜[45]。针刺内关穴能有效提升心肌ATP的含量，改善心肌细胞的能量代谢[46]。唐雅妮等[47]基于核磁共振氢谱(1HNMR)观察内关预处理对MIRI大鼠血清和心肌组织代谢物的影响，发现内关预处理可调节糖代谢、脂肪酸代谢、氨基酸代谢及能量代谢，从而增强心肌细胞的活力。陈美琳[48]进一步发现内关穴预处理抗MIRI的血清代谢模式具体表现为葡萄糖上升，支链氨基酸下降，三羟基丁酸、乳酸、醋酸盐、丙酮、乙酰乙酸、丙酮酸、谷氨酰胺、肌酸和丙三醇下降，证明电针内关预处理通过改变MIRI大鼠糖代谢、丙酮酸代谢、氨基酸代谢和酮体代谢模式，从而减轻心肌的损害，但其具体的代谢通路及机制仍需进一步研究。

9 调控相关信号通路

9.1 miRNA-214/Ca2+信号通路

micro RNA是一种内源性的小核苷酸片段，其中mi RNA-214在缺血再灌注的损伤机制中发挥重要作用。Aurora等[49]发现在缺血性损伤和心衰时micro NA-214表达上调，并表现出对MIRI的保护作用;而敲除micro RNA-214后的大鼠对抗缺血再灌注损伤时，其编码的钠/钙交换通道1(NCX1)表达增加并导致细胞钙离子浓度上升，出现心肌收缩障碍。提示miRNA-214/Ca2+通路介导了MIRI时的心脏内源性保护机制。柳培雨[50]通过体内外动物实验发现，内关预处理可以诱导miRNA-214表达上调，抑制氧糖剥夺所致的Ca2+增加，下调下游相关蛋白CaMKIl8、BIM和CypD，减少钙超载诱导的细胞死亡。证实了miRNA-214/Ca2+信号通路参与了电针内关预处理抗MIRI的细胞分子机制。

9.2 MARK信号通路

丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路在调控基因表达和细胞质功能中具有关键作用，可通过P38 MAPK、P44/42 MAPK和SAPK/JNK这3条途径诱导心肌细胞凋亡和炎症反应，进而参与I/R的病理生理进程[51]。黄艳等[52]研究进一步显示，p38 MAPK信号途径在参与I/R损伤时活性减弱，经电针预处理后激活，而蛋白P-SAPK/JNK、P-P44/42在I/R时表达增加，在内关电针预处理后则被抑制。说明电针内关预刺激能通过激活p38 MAPK信号途径，抑制P44/42 MAPK和SAPK/JNK信号途径来参与MARK信号通路对心肌的调控，从而达到改善MIRI的效果。

9.3 迷走神经-肥大细胞通路

肥大细胞广泛分布于心脏黏膜、微血管，机体遭受MI/R刺激时，其脱颗粒释放的炎性反应物质如TNF-α、组胺等，会扩大心肌损伤程度[53]。周洁等[54]研究结果显示，电针内关预处理可以缩小MIRI大鼠心肌梗死面积，并减小肥大细胞脱颗粒率，提示电针预处理诱导的肥大细胞脱颗粒降低可能在实验中发挥了抗MIRI的保护效应。且实验进一步发现，大鼠迷走神经一旦被切断，电针内关穴预适应则无法产生上述心肌保护作用；而刺激迷走神经后，心肌肥大细胞脱颗粒再次被抑制，心肌保护效应恢复，提示迷走神经参与了该保护效应机制。基于此，针刺内关预处理对心肌的保护作用可能通过调节迷走神经-肥大细胞通路而实现。

10 讨论

心肌缺血再灌注损伤的病变部位在心，临床上主要表现为胸痛、胸闷、短气、疲乏无力和心慌等不适，应属中医学“胸痹心痛”范畴。东汉张仲景《金匮要略·胸痹心痛短气篇》中对胸痹的症状和病机做了深刻的论述：“胸痹之病，喘息咳唾,胸背痛,短气”“夫脉当取太过不及，阳微阴弦，即胸痹而痛，所以然者，责其极虚也。”故本病是以脏腑虚损、气血阴阳不足为本、瘀血痰浊等有形之邪为标的“本虚标实”之证，治疗上当以扶正祛邪、标本兼治为法。然而，目前在临床上对于MIRI并无确切的疗法，大多仍以预防为主。针灸预处理作为一种安全有效的预防性干预措施，源于“治未病”理论，其可以发挥内源性保护效应，调动各种自身调节机制从而维持内环境稳态。内关穴首见于《灵枢·经脉》曰：“手心主之别，名曰内关，去腕二寸，出于两筋之间……实则心痛，虚则为头强。取之两筋间也。”内关是历代医家治疗心系疾患的常用穴位，因其疗效甚佳，后人更是在明代朱权所载的《四总穴歌》基础上增补了“心胸内关谋”之说，凸显了内关与心脏的特异性联系。因此，在内关穴进行针灸预处理充分结合了针灸优势、腧穴作用及机体内源性保护机制的三重效应，无疑为MIRI的防治提供了新启发以及广阔前景。

目前，关于针灸内关预处理抑制MIRI作用机制的研究虽已深入到分子和基因的水平，并为针灸防治MIRI在临床的应用提供了有力的支持。然而，就现今研究状况而言，仍存在一些问题:①研究多集中于临床前实验，且动物样本量较少，说服力不够；②试验所选取的针灸手法、刺激强度和频率缺乏量化标准，针刺介入时间和干预周期缺乏规律性探索；③内关与其他腧穴、针灸与其他疗法共同运用协同增效的机理研究仍待进一步发掘;④大多数研究指标局限于常见心功能指标或单一蛋白、基因的表达，缺乏更深层次的探讨。因此，建议加强内关穴与其他穴位或者针灸与其他疗法联合防治MIRI的研究，提高相关的信号通道、受体途径以及基因等方面的研究，为针灸内关预处理防治MIRI提供更完善的理论支持。