针灸对腰神经根受压模型大鼠疼痛症状的改善及对腰受损神经根组织的炎症抑制作用

李绍康,和婧伟,赵 洁,曹晓雯,刘陟清,朱 森

(1.上海市浦东新区公利医院，上海 200135; 2.复旦大学附属儿科医院，上海 201102)

腰椎间盘突出症(Lumbar disc herniation，LDH)是在腰椎间盘退变的基础上，髓核突出、纤维环破裂，对神经根及马尾神经造成压迫、刺激导致腰腿痛和坐骨神经痛的一种临床综合征[1]。目前LDH治疗方式包括手术治疗、非手术治疗，手术治疗风险高、创伤大，患者接受度低，非手术治疗包括药物口服、推拿和封闭疗法等，多数患者在非手术治疗情况下症状能得到有效缓解[2-3]。研究发现[4]，突出椎间盘及骨赘形成导致的机械性压迫，以及受压神经根或炎性侵入性细胞所自发分泌的多种因子及神经肽类物质引发的非特异性炎症反应，均是导致患者出现腰腿痛的重要原因。针灸是常见的中医保守干预方式，临床已有关于其治疗神经病理性疼痛的研究，可有效减轻患者疼痛、提升其生活质量，且安全性高[5]。然而，目前鲜有关于针灸对LDH腰受损神经根组织炎症反应的影响及具体机制的报道。鉴于此，本研究通过建立腰神经根受压大鼠模型，观察针灸对其疼痛症状及腰受损神经根组织炎症反应的影响，并探讨相关机制，以期指导腰椎间盘突出症的临床治疗。

1 材料与方法

1.1 实验动物

50只SD大鼠，雄性，SPF级，7周龄，体质量(200±20)g，购自中国科学院上海药物研究所，使用许可证号：SYXK(沪)2019-0032。大鼠购入后饲养于清洁、通风环境，温度(23±2)℃，湿度(60±5)%，明暗周期12 h/12 h循环。

1.2 药物与试剂

布洛芬缓释胶囊(上海信谊天平药业有限公司,国药准字H31022720,0.3 g)；戊巴比妥钠(上海信裕生物科技有限公司)；白细胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)及白细胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)ELISA试剂盒(上海谷研实业有限公司)；Trizol试剂盒、全蛋白提取试剂盒和BCA蛋白定量试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司)；兔抗大鼠Toll样受体4(Toll like receptor 4，TLR4)多抗、髓样细胞分化因子88(Myeloid differentiation factor 88，MyD88)和核转录因子κB(Nuclear transcription factor κB，NF-κB)单抗(美国Abcam公司);辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体(北京中山金桥生物技术有限公司)。

1.3 仪器

RS-6687手术放大镜(深圳市泽拓生物科技有限公司)；大鼠柔性固定器(温州原上草医疗科技有限公司)；热痛测试仪(美国IITC Life Science公司)；Synergy H4全功能酶标仪(美国Bio Tek公司)；EG1150分体式包埋机、SM2010R切片机(德国LeicaMicrosystems贸易有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 模型建立及分组 参考文献[6]建立大鼠腰神经根受压模型。取50只SD大鼠，戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔注射麻醉，除去背部毛发，俯卧位固定于操作台，常规消毒、铺巾。以L4～5棘突间隙为中心，后背正中切口，长度约4 cm，逐层分离皮肤、皮下组织，自动牵钩拉开，咬骨钳将右侧L4～5棘突、关节突及椎板咬除，在手术放大镜探查下充分暴露右侧L5神经根及马尾神经，将2 mm×2 mm×1 mm特制硅胶片置于酒精中消毒2 h后填塞入右侧L5神经根硬膜囊腋部，固定后常规缝合，切口处涂抹金霉素软膏，注射8万U青霉素以预防感染，连续3 d。10只大鼠仅切开皮肤与椎旁肌，设为假手术组。术后大鼠苏醒后放回笼中观察3 d，建模成功标准：右侧下肢肿胀，行走时右足外翻甚至间歇性跛行。将建模成功的31只大鼠随机分为模型组(10只)、针灸组(10只)和阳性药物组(11只)。

1.4.2 干预方式 确定建模成功将大鼠分组后即建模后第4天开始干预。针灸组选取L5受压神经根右侧夹脊穴，参照《实验针灸学》中相关标准进行穴位定位[7]，将大鼠固定后，选取0.25 mm×13 mm华佗牌针灸针，针刺深度为5 mm，留置20 min，1次/d；假手术组与模型组每天仅固定20 min，不实施针灸；阳性药物组采用布洛芬缓释胶囊60 mg/(kg·d)灌胃，每天早晚分2次干预。干预时间为21 d。

1.4.3 热痛阈值测定 干预前、干预后7 d、14 d和21 d采用热痛测试仪测定大鼠热痛阈值，光源辐射点对准大鼠左侧后足底部正中位置，待其出现舔后足时结束计时，该段时间(s)即为热痛阈值。光源辐射最长时间为25 s，防止损伤大鼠足底。每次重复测试3次，间隔5 min，取平均值。

1.4.4 组织取材 末次测定热痛阈值后4 h脱颈处死大鼠，暴露右侧L5神经根，冰盘上迅速剖开切取受压神经根，每组随机选取5只大鼠受压神经根组织迅速置于40%中性甲醛固定备用，5只大鼠受压神经根组织保存于-80 ℃备用。

1.4.5 ELISA法测定腰受损神经根组织IL-6、TNF-α及IL-1β浓度 取冷冻保存的腰受损神经根组织50 mg，与1 mL PBS混合，匀浆器10 000 r/min离心10 min匀浆，离心半径10 cm，取上清，采用ELISA法测定组织中IL-6、TNF-α及IL-1β浓度，严格根据IL-6、TNF-α及IL-1β ELISA试剂盒说明书设计操作步骤，经酶标仪读取波长570 nm处吸光度值，绘制标准曲线后计算各因子浓度。

1.4.6 HE染色观察腰受损神经根病理变化 取40%中性甲醛固定备用的受压神经根组织，酒精梯度脱水、石蜡包埋，制作成5 μm厚度连续切片，取切片二甲苯脱蜡、酒精水化，常规HE染色，中性树胶封片，置于显微镜下观察腰受损神经根病理变化。

1.4.7 QRT-PCR法测定腰受损神经根组织TLR4、MyD88、NK-κBp65 mRNA表达量 取冷冻保存的腰受损神经根组织50 mg，经Trizol试剂盒提取总RNA，测定RNA纯度及浓度后，经逆转录试剂盒获得cDNA，经产物鉴定后行QRT-PCR。设计反应体系及反应条件时严格按照荧光定量试剂盒说明书进行：5 μL 10×buffer，dNTP 0.4 μL，上下游引物各1 μL，模板cDNA 4 μL，Taq酶5 μL，dd H2O 3.6 μL，总反应体系20 μL；96 ℃预变性10 min，96 ℃变性30 s，60 ℃退火10 s，70 ℃延伸60 s，40个循环。以β-actin为内参对照，采用2-△△CT计算目的基因的相对表达水平。引物序列见表1。

表1 各基因引物序列

1.4.8 Western blot法测定腰受损神经根组织TLR4、MyD88及NK-κBp65蛋白表达量 取冷冻保存的腰受损神经根组织50 mg，冰上匀浆，离心后取上清液，按照全蛋白提取试剂盒、BCA试剂盒说明书分别进行总蛋白的提取及定量，沸水浴5 min变性，取40 μg待测样本混合等量上样缓冲液，制备SDS聚丙烯酰胺凝胶，电泳恒压分离，电转至聚偏二氟乙烯膜，5%脱脂奶粉4 ℃封闭过夜，加入1∶1 000稀释的TLR4多抗，MyD88、NK-κBp65单抗，洗膜后，加入1∶10 000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗，室温孵育2 h，洗膜后，加入ECL发光液，暗室中显影、定影，采用Image J软件分析，以目的蛋白灰度值与β-actin灰度值的比值表示目的基因蛋白表达量。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 干预前后各组热痛阈值比较

干预后7 d、14 d和21 d与假手术组比较，模型组、针灸组和阳性药物组热痛阈值均降低，差异有统计学意义(P<0.05)；干预后7 d、14 d和21 d与模型组比较，针灸组、阳性药物组热痛阈值均升高，差异有统计学意义(P<0.05)；干预后7 d、14 d和21 d与针灸组比较，阳性药物组热痛阈值均升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与干预前比较，假手术组干预后7 d、14 d和21 d热痛阈值均升高，差异有统计学意义(P<0.05)，两两比较差异无统计学意义(P>0.05)；与干预前比较，模型组干预后7 d、14 d和21 d热痛阈值均降低，差异有统计学意义(P<0.05)，两两比较差异无统计学意义(P>0.05)；与干预前比较，针灸组干预后7 d热痛阈值降低，干预后21 d热痛阈值升高，差异有统计学意义(P<0.05)，干预后14 d与干预前比较，差异无统计学意义(P>0.05)；与干预前比较，阳性药物组干预后7 d疼痛阈值差异无统计学意义(P>0.05)，干预后14 d、21 d热痛阈值升高，差异有统计学意义(P<0.05)，干预后7 d、14 d和21 d呈升高趋势，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 干预前各组热痛阈值比较

2.2 各组腰受损神经根组织IL-6、TNF-α和IL-1β浓度比较

与假手术组比较，模型组、针灸组和阳性药物组腰受损神经根组织IL-6、TNF-α和IL-1β浓度均升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，针灸组、阳性药物组腰受损神经根组织IL-6、TNF-α和IL-1β浓度均降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与针灸组比较，阳性药物组腰受损神经根组织IL-6、TNF-α和IL-1β浓度均降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组腰受损神经根组织IL-6、TNF-α及IL-1β浓度比较

2.3 各组腰受损神经根组织病理变化观察

HE染色显示，假手术组细胞密度均匀，核仁清晰，细胞质中可观察到颗粒状物均匀排列；模型组腰受损神经根中神经元细胞肿胀，细胞核发生不规则变化，核仁模糊，细胞浆发生空泡样改变，胞浆中可观察到颗粒状物不均匀排列；针灸组与阳性药物组经干预后上述病理变化有所改善，部分神经元细胞可观察到核偏移，核仁较清晰，细胞质密度较均匀，且阳性药物组改善优于针灸组。见图1。

2.4 各组腰受损神经根组织TLR4、MyD88、NK-κB p65 mRNA表达量比较

与假手术组比较，模型组、针灸组和阳性药物组TLR4、MyD88和NK-κB p65 mRNA表达量均升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，针灸组、阳性药物组TLR4、MyD88和NK-κB p65 mRNA表达量均降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与针灸组比较，阳性药物组TLR4、MyD88和NK-κB p65 mRNA表达量均降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 各组腰受损神经根组织TLR4、MyD88、NK-κB p65 mRNA表达量比较

2.5 各组腰受损神经根组织TLR4、MyD88及NK-κB p65蛋白表达量比较

与假手术组比较，模型组、针灸组和阳性药物组TLR4、MyD88及NK-κB p65蛋白表达量均升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，针灸组、阳性药物组TLR4、MyD88及NK-κB p65蛋白表达量均降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与针灸组比较，阳性药物组TLR4、MyD88和NK-κB p65蛋白表达量均降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5和图2。

表5 各组腰受损神经根组织TLR4、MyD88、NK-κB p65蛋白表达量比较

3 讨论

随着生活、工作方式的转变及老龄化社会进程的加快，LDH已成为临床常见病，其以反复坐骨神经痛及腰痛为主要临床表现，严重影响患者生活与工作。目前临床认为LDH的发病与腰椎间盘退行性变导致的无菌性炎症、腰椎间盘突出形成的机械性压迫、免疫反应、急性或慢性损伤等密切相关，以椎间盘组织失去正常髓核及纤维环结构、组织破坏、纤维排列松散、灶性炎症细胞浸润及血管化等为主要病理改变[8-9]。因此，缓解LDH受压神经根疼痛、减轻炎症反应是治疗该病的关键。

既往报道显示[10-11]，腰椎神经根机械性受压并非导致神经根性疼痛、机能障碍的唯一原因，同时炎症介质也是诱发神经根性疼痛及化学性神经炎的关键因素。随着研究的逐渐深入，IL-6、TNF-α和IL-1β等致炎因子在突出的椎间盘组织中被发现，成为反映炎症反应程度的可靠指标。本研究结果显示，干预后各时间点模型组、针灸组、阳性药物组和假手术组热痛阈值依次升高，腰受损神经根组织IL-6、TNF-α和IL-1β浓度均依次降低，提示针灸可提升腰神经根受压大鼠热痛阈值，减轻炎症反应；HE染色显示，模型组腰受损神经根中神经元细胞肿胀，细胞核不规则变化，核仁模糊，细胞浆空泡样改变，针灸组与阳性药物组经干预后上述病理变化有所改善，提示针灸可减轻大鼠腰受损神经根病理改变。中医认为[12-13]，LDH属“痹证”“腰痛”等范畴，肝肾亏虚为本，风寒湿热为标，气滞血瘀、经脉失养，治疗关键在于通络活血、化瘀镇痛。夹脊穴内夹督脉，外临膀胱经，通过“督脉之别”使督脉和膀胱经得以发挥作用，且与脾、胃等脏腑背俞相邻。针刺夹脊穴可直达病灶，起到调和脏腑气血、疏通经络脉道的作用。现代药理学证实[14]，针灸可刺激脑腓肽神经元与兴奋神经粗纤维，从而发挥镇痛效果；促进针刺周围血管扩张，增加局部血流量，改善微循环，减轻受压神经根炎症浸润所致的充血与水肿。张寒等[15]采用针刺治疗LDH大鼠模型，可减轻其疼痛，改善运动障碍，本研究结论与其具有相似性。

TLRs/MyD88信号通路是生物进化中重要的炎症反应介导通路。TLR4通过识别外源性配体或内源分子，与Toll-白细胞介素-1受体同源区互相作用发生二聚化，激活下游MyD88后通过胞内信号传导最终激活NF-κB信号通路，促进巨噬细胞、单核细胞释放IL-6、TNF-α及IL-1β等细胞因子，介导炎症生物学效应。既往动物研究显示[16]，柴胡提取物可通过TLRs信号通路减轻罗非鱼炎症损伤，提示该通路在介导炎症反应中具有重要作用。陈秋欣等[17]采用针刺治疗急性脑出血大鼠时发现，针刺可能通过负调控TLRs/MyD88信号通路减轻脑出血后炎性损伤，保护脑组织。此外，梁英业[18]研究证实，下调TLRs/MyD88信号通路可有效减少炎症因子释放，从而达到治疗神经病理性疼痛的目的。本研究结果显示，模型组、针灸组、阳性药物组和假手术组TLR4、MyD88、NK-κB p65 mRNA及蛋白表达量依次降低，提示针灸对腰神经根受压大鼠疼痛、炎症反应和病理变化的改善作用可能通过抑制TLR4/MyD88信号通路实现。

综上所述，针灸可有效减轻腰神经根受压模型大鼠疼痛，抑制炎症反应，改善腰受损神经根病理变化，推测其作用机制与下调TLR4、MyD88、NK-κB p65 mRNA及蛋白表达、抑制TLR4/MyD88信号通路有关，为临床该病治疗提供理论基础。关于针灸治疗腰神经根受压时是否存在其他调控机制仍需深入探讨。