基于内质网应激探讨针刺治疗脑病的研究概况

于晨光，邹 伟

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040;2.哈尔滨市中医医院，黑龙江 哈尔滨150000；3.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

脑病是指因遗传、脑瘫、脑出血、脑梗、化学药物中毒和感染等引起脑神经组织损伤，并造成脑功能障碍。脑是人体最为重要的器官之一，其血供占心输出血量的15%左右，而耗氧量却占全身耗氧的20%以上，所以对缺血缺氧的环境及其敏感，其中脑缺血以大脑中动脉梗塞最为常见。脑缺血如果未在一定时间内恢复血流供应，那么脑组织的损伤和功能障碍会持续加重，甚至造成不可逆性的损伤。其损伤机制主要有氧化应激损伤学说、炎性反应学说、细胞凋亡学说、神经、血管再生学说、脑水肿学说等。脑组织损伤后，脑细胞的正常代谢被破坏，一系列应激反应被激活，例如内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)和未折叠的蛋白质反应(Unfolded protein response,UPR)，导致细胞稳态或细胞死亡的重建，内质网应激的最终结果决定了细胞是存活还是经历程序性细胞死亡。内质网应激相关的UPR在疾病中的重要作用机制已被深入研究[1]。ERS信号调节的时机可能对神经细胞生存和凋亡的平衡很重要，ERS最初是保护性的，旨在恢复内质网稳态，而延长的ERS可能有害[2]。在哺乳动物细胞中，自噬主要有3种亚型:巨噬、微噬和伴侣介导的自噬[3]。ERS持续存在可以激活伴侣介导的自噬，受损的内质网可被自噬囊泡部分吞噬并降解，降解的内质网片段可以重新组装成新的内质网，从而恢复其正常状态[4]。本研究主要从ERS研究概况、ERS与自噬和凋亡的相互影响、针刺对ERS调控作用等方面进行概述，以期为针刺方法治疗脑病提供更多有效、可靠的依据。

1 内质网应激研究概况

1.1 内质网应激与氧化应激

内质网(ER)是一种动态的、膜结合的细胞器。内质网与核膜相连，并以网状排列的连接囊和分支小管的形式延伸至整个细胞质。内质网承载着合成各种脂类的代谢途径，包括胆固醇、磷脂和中性脂类。内质网上蛋白质的生产受到一系列机制调控，这些机制负责协调分泌整合膜蛋白的折叠、修饰和展开[5]。在真核细胞中，内质网对进入分泌途径的蛋白质的折叠和运输过程至关重要[6]。为了维持蛋白质稳态，以ER为靶点的蛋白质被正确折叠是至关重要的。因为错误折叠的蛋白质，长期积累可能导致细胞毒性聚集物的形成[7]。只有完全正确的折叠蛋白才可能从ER转运至高尔基体，任何干扰氧化还原反应的调控都会激活ERS。氧化应激(Oxidative stress,OS)时,UPR的激活是一个自适应机制，用以维护细胞的存活和保障细胞的功能，持续的OS和蛋白质错误折叠会引起细胞凋亡这一级联反应[8]。缺血性脑病影响脑细胞内ATP以及PH值的波动程度。通过破坏ATP依赖的离子转运，引起线粒体内钙超载并激活OS和ERS。该病理过程影响线粒体的通透性，从而导致细胞裂解和凋亡[9]。UPR是一种细胞内信号网络，主要由3种ER跨膜蛋白控制。分别为蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、肌醇酶(IRE1)和激活转录因子6(ATF-6)。这3种蛋白共同监测ER的蛋白折叠状态，并启动纠正措施来维持内质网稳态[10]。

1.2 内质网应激与细胞凋亡

凋亡是细胞死亡的一种形式，机体通过这种形式维持内环境稳态。缺血性脑病发生后，由于脑部血供中断引起神经元出现损伤，从而走向不同的命运：凋亡、坏死及自噬。凋亡主要分为内源性途径(线粒体途径)、外源性途径(死亡受体途径)和ERS诱导的凋亡这3种途径[11]。ERS诱发自适应性程序的启动，从而激活蛋白折叠。并掌控质量控制机制以及降解途径，同时也可以在损伤不可逆时激活细胞凋亡[12]。ERS初期，UPR可诱导启动IRE1、PERK和ATF6这3条信号通路，同时激活脑细胞的促生存模式。使脑细胞在应激状态下具有自我调节、自我修复的能力。但长时间剧烈的ERS反而会激活凋亡[13]。非选择性ERS诱导的细胞凋亡被认为是多种疾病的重要致病因素。C/EBP同源蛋白(C/EBP Homologous Protein,CHOP)和肌醇必需酶1α(Inositol-requiring enzyme 1α,IRE1α)的激活可诱导应激超负荷条件下的细胞凋亡[14]。

1.3 内质网应激与自噬

自噬是一种保守的细胞内分解代谢途径，保证了细胞内和胞质成分的降解、更替和更新[15]。神经系统细胞内未折叠、不可溶解和受损的蛋白质长期积累，可诱发ERS和自噬[16]。自噬具有溶酶体介导的功能，可消除受损以及老化的蛋白质和细胞器，对恢复细胞稳态是必需的[17]。自噬通过将细胞质部分隔离，形成以超微结构为特征的双层膜结合囊泡，该囊泡称为自噬体。自噬体在与溶酶体相融合后,可对隔离胞质蛋白和细胞器产生降解作用[18]。科学研究表明抑制自噬可放大脑缺血再灌注诱导的损伤。而通过药物刺激作用于自噬的方式，可提升脑组织对缺血再灌注的承受能力[19]。但自噬也被认为是一把双刃剑，过量地激活或抑制自噬会破坏大脑内蛋白质和细胞器的稳态，并在神经细胞凋亡中发挥作用[20]。ERS、自噬与凋亡之间存在常见的上游信号通路，包括PERK/ATF4、IRE1α、ATF6和Ca2+。自噬不仅可以通过抑制与凋亡相关的胱天蛋白酶的活化来阻断凋亡的诱导，还可以诱发凋亡[21]。

1.4 内质网应激与血管内皮细胞

血管内皮细胞通常附着在心、脑血管以及淋巴管内表面单层扁平上皮，可以配合形成血管的内壁。具有吞噬异物、坏死细菌或衰老组织的作用，还可参与机体免疫活动。正常血管内皮细胞在维护血管的通透性、调节血液与组织的交换、调节血管张力、调控炎性免疫反应以及维持血流通畅等方面都发挥重要的作用[22]。研究表明[23]ERS通过激活OS与p38MAPK途径可引起血管内皮功能障碍。ER在脑组织缺血、缺氧以及氧化应激时出现功能紊乱，表现为蛋白错误表达、钙超载等。同时激活OS过程，并造成脑损伤，所以ERS是引起内皮细胞损伤的一种途径[24]。

2 针刺对内质网应激调控作用概况

2.1 针刺对PERK蛋白影响

PERK是一种内质网驻留跨膜蛋白激酶，可启动促凋亡和促生存信号通路[25]。PERK可以磷酸化真核细胞起始因子2α(eukaryoticinitiation factor 2α，elF2α)，从而抑制细胞中蛋白质的合成。PERK还可以通过活化转录活化因子4从而上调CHOP蛋白的表达，参与内质网应激反应过程[26]。陈理军等[27]选取健康成年树鼩126只，通过颈动脉交替夹闭制备脑损伤模型。用RT-PCR检测不同时间点海马组织PERK表达的变化，所选检测的时间点为脑损伤后4 h、24 h和72 h。检测结果表明树鼩脑损伤可激活患侧海马ERS反应，引起PERK蛋白表达增高。邹伟等[28]选取Wistar大鼠120只，采用自体血注射的方式制备急性脑出血模型，针刺组用百会透刺曲鬓这一干预方法。分为空白对照组、模型组、针刺组、抑制剂+针刺组和自噬抑制剂组5组，每组24只，分为4个亚组(造模成功后12 h、1 d、3 d和7 d)。用Western Blot法分析血清PERK蛋白表达量的变化，用改良神经缺损评分系统评价大鼠神经功能的变化。结果表明,除了空白对照组外，其余各组PERK蛋白有明显变化。其中6 h最低，7 d最高；相同时间点针刺组表达量最高，抑制剂组表达量最低；神经功能缺损情况针刺组最轻，自噬抑制剂组最严重。实验结果说明百会透曲鬓针刺方法对急性脑病大鼠的神经功能恢复具有积极作用。可提高PERK蛋白表达量，从而起到脑保护以及神经修复作用。

2.2 针刺对IRE1蛋白的影响

IRE1是一种ER跨膜传感器，可激活UPR以维持ER稳态和细胞功能。尽管哺乳动物的IRE1蛋白可以促进细胞存活，但也可以通过抗凋亡miRNA的降解来启动细胞凋亡[29]。IRE1激活可导致核糖核酸内切酶的混杂活性，导致ER膜处的mRNA衰减，从而有助于减少蛋白质负荷，这一过程被称为调控IRE1依赖性衰减(RIDD)。不仅增加了细胞蛋白质的折叠能力，还增加了蛋白质降解和转运途径，有助于减轻ER错误折叠蛋白的影响[30]。IRE1的活化会激活自身核酸内切酶的活性，剪切X-核结合蛋白1这一片段经翻译后入核，行使其转录因子功能并发挥UPR反应的保护作用[31]。Gao Y L等[32]选用48只雄性SD大鼠随机分为空白对照组、毒品组和毒品+针刺组。后两组均用毒品连续注射方式造成毒品依赖性脑病模型，毒品+针刺组增加电针(EA)这一干预手段。采用末端脱氧核苷酸转移酶划痕标记法(TUNEL)观察各组大鼠海马和腹侧被盖区神经细胞凋亡情况。分别采用RT-PCR法和免疫组化法检测IRE1、PERK、CHOP基因表达和蛋白表达。结果表明电针+毒品组在IRE1、PERK和CHOP等蛋白表达水平均低于毒品组。说明针灸具有调节ER稳态作用，针刺对毒品成瘾大鼠损伤神经细胞具有保护作用。抑制CHOP的上调及减少神经细胞凋亡可能是针刺对海洛因成瘾脑损伤作用的主要机制。马骏等[33]通过电针治疗帕金森病模型大鼠，经检测得出针刺组大鼠黑质内IRE1α蛋白表达水平较对照组显著降低，说明电针风府穴、太冲穴可以有效抑制与ERS相关的IRE1蛋白的活性。

2.3 针刺对ATF-6蛋白的影响

哺乳动物肌醇需要酶1α(IRE1α)是所有内质网(ER)应激传感器中最为保守的，它包括转录激活因子ATF6和PERK。ATF6可以诱导XBP1 mRNA转录，促进特定基因的表达从而可以减轻ERS，维持细胞稳态以及抑制凋亡的出现[34]。吴家鹏等[35]选取40只雄性SD大鼠，随机分为假手术组、模型组、电针(EA)组、内皮生长因子(VEGF)组和EA+VEGF组(每组8只)。通过右侧颈总动脉结扎的方式造成脑缺血性脑病模型。针刺组选穴为百会、曲池和足三里，每次30 min，持续治疗14 d。对于VEGF组和EA+VEGF组的大鼠，成功建模后24 h将10 μL VEGF(0.025 μg/μL)注入侧脑室。观察指标选用神经系统缺损评分以及检测各组大鼠脑组织AFT6、IRE1以及CHOP的蛋白表达水平。该动物实验结果表明,EA和EA+VEGF改善大鼠神经功能缺损优于其他组，说明EA可促进脑组织修复；ERS相关蛋白ATF6、IRE1和CHOP蛋白表达方面，EA+VEGF组明显低于其他组，说明EA+VEGF的效果优于单纯EA和单纯VEGF。

2.4 针刺对CHOP蛋白的影响

ERS情况下ATF6、IRE-1和PERK等蛋白的活化均对CHOP有诱导激活的调控作用，可增加其蛋白的表达，从而诱导细胞凋亡和自噬[36]。CHOP可称为生长停滞与DNA诱导损伤基因，属于C/EBP家族的一员。CHOP通过下调Bcl-2的表达和增强ROS的产物来发挥促凋亡作用[37]。CHOP是激活ERS并诱发凋亡的标志性基因[38]。张慧等[39]对刚出生的SD大鼠海马神经元进行原代培养10 d。然后再随机分为正常细胞外液组、无Mg2+培养基组、针灸血清组和无针灸血清组4组(n=30)。使用五甲烯四氮唑制备急性惊厥SD大鼠血样。通过针刺百会和大椎作为针刺干预手段连续针刺7 d，制备针灸血清。应用Tunel法检测针刺血清和非针刺血清在3 h、12 h和48 h时间点的细胞凋亡情况，并分析CHOP蛋白的表达量。结果表明针刺血清能明显减少海马神经元凋亡，可下调CHOP蛋白的表达，提示针刺对维持内质网稳态有积极作用。舒适[40]通过动物实验表明,电针水沟穴对脑神经功能缺损大鼠的恢复有明确作用，其机制为调控ERS、减弱CHOP表达以及抑制自噬等方面共同发挥作用。

3 总结

近年来，凋亡、自噬和ERS在脑病防治方面的作用机制问题受到广泛关注。ERS初期是具有保护作用的，可以维持神经细胞稳态，但过量的激活却又会激活凋亡、自噬程序。研究表明过量的激活可以启动自噬程序，可反向降低ERS水平，从而维持细胞稳态。ERS与自噬、凋亡在动态平衡下共同维持细胞稳态，从而降低脑病后继发的破坏性反应。本研究从研究针刺对PERK、IRE1、ATF-6及CHOP蛋白表达的影响着手，探究针刺对ERS与自噬、凋亡和氧化应激等相互影响的调控机制，以期为针刺治疗脑病提供理论依据。然而通过对ERS和脑病防治的相关性研究中也发现一些问题：调控ERS治疗脑病的靶点不明确；ERS如何与其他细胞器配合共同调控自噬、凋亡以及OS的机制尚不明确；ERS防治脑病多见于基础理论分析以及动物实验,少有临床应用的报道，说明临床尚未普及和推广。因此，如何通过针刺方法或通过药物干预手段减轻过度ERS以有效对抗血管内皮细胞凋亡、自噬或将成为未来该领域新的研究热点。希望本研究能为针刺调控ERS治疗脑病这一方法提供更多的循证医学依据以及理论支撑。