高通量测序在2例肾病综合征并发感染患者病原诊断中的应用

陈树娟，李虎才，王立新

(1. 广州中医药大学第二临床医学院，广东 广州 510000； 2. 广州中医药大学第二附属医院肾内科，广东 广州 510120)

肾病综合征(nephrotic syndrome, NS)患者由于免疫功能受损及使用糖皮质激素、免疫抑制剂等导致其免疫功能低下，常出现严重的细菌、真菌、病毒等混合性感染。感染起病隐匿，临床症状不典型，病情进展迅速，是导致NS患者全因死亡的主要原因[1]。由于检测技术的限制、抗菌药物的使用及免疫功能低下等，传统检测技术对致病菌总体检出率偏低，且检测耗时长，给临床诊断及治疗带来困难。分子诊断和基因诊断是目前感染性疾病病原学诊断中的一个重要方向和研究热点，高通量测序即下一代测序技术(next-generation sequencing, NGS)，利用现有微生物群基因信息群，采用生物信息学方法，与测序结果比对，进而鉴别微生物种类，具有检测耗时短、覆盖面广等优点。近年来NGS广泛应用于血流感染、肺部感染、中枢神经系统感染等多种感染性疾病，因其可快速检测和全面识别病原菌，且病原菌阳性检出率远高于传统检测，具有显著的优势及应用价值[2-4]。目前关于NGS在NS并发感染中的研究报道较少。本文通过分析某院利用NGS明确诊断NS并发隐球菌感染及嗜麦芽窄食单胞菌脑膜炎各1例，探讨NGS在NS并发感染中的应用。

1 病历资料

1.1 病例1 患者女性，58岁，2021年10月25日因“发现双下肢浮肿6个月余，发热咳嗽10 d”收入我科，既往有高血压病史。6个月余前，患者因NS行肾穿活检诊断为Ⅲ期膜性肾病，予足量糖皮质激素及环磷酰胺治疗。10天前患者出现咳嗽、咯痰伴发热，体温最高达39.5℃，于外院行实验室检查：血白细胞计数12.49×109/L，中性粒细胞百分比88.5%，C反应蛋白(CRP)205.56 mg/L，降钙素原(PCT)0.129 ng/mL，血沉104 mm/h；尿白细胞计数158个/μL；痰培养检出白念珠菌。胸部CT提示左肺下叶见斑片状高密度影，考虑左肺下叶炎症。先后予头孢呋辛、哌拉西林钠/他唑巴坦钠抗感染，病情无好转，为进一步治疗，入我科。

入院时患者精神疲倦，咳嗽，干咳少痰，发热，双颞部及颈部轻度疼痛。查体：体温38.6℃，听诊双肺呼吸音粗，双下肺可闻及散在湿啰音，颈软，无抵抗，凯尔尼格征及布鲁津斯基征阴性，生理反射存在，病理反射未引出。实验室检查：血白细胞计数6.35×109/L，中性粒细胞百分比74.5%，淋巴细胞百分比15.5%，CRP 45.38 mg/L，PCT 0.06 ng/mL，血沉72 mm/h，血肌酐 38 μmol/L；尿白细胞计数70.6个/μL；淋巴细胞亚群：CD4+T淋巴细胞(CD3+CD4+)31.39%，CD4+T淋巴细胞亚群/CD8+T淋巴细胞亚群0.97。胸部CT平扫提示双下肺感染，诊断为NS并发感染。患者长期使用糖皮质激素及免疫抑制治疗，外院抗感染无效，考虑存在细菌、真菌、病毒等混合感染可能，经验性予舒普深(3 g，q12h)+氟康唑(0.2 g，qd)+更昔洛韦(0.3 g，q12h)静脉滴注抗感染治疗。留取浅部痰、尿、血标本行细菌、真菌病原学培养以及肺炎支原体、抗巨细胞病毒(CMV)-IgM、CMV、呼吸道病毒、曲霉菌GM抗原等检测均为阴性。遂完善支气管镜检查，留取深部痰及肺泡灌洗液行病原菌培养，肺泡灌洗液行NGS检测，深部痰及肺泡灌洗液培养均为阴性，NGS结果提示隐球菌感染。患者脑膜刺激征阴性，但存在双颞部及颈部疼痛，考虑隐球菌与中枢神经系统有高度亲和性，行腰椎穿刺检测回报脑脊液常规：白细胞计数106×106/L，中性粒细胞13%，淋巴细胞87%；脑脊液生化：葡萄糖1.87 mmol/L，蛋白550 mg/L；血清、脑脊液隐球菌荚膜多糖抗原阳性；脑脊液墨汁染色、细菌培养均阴性。患者NS并发隐球菌性肺炎及脑膜炎可诊断。调整抗感染方案，氟康唑加量(0.4 g，qd)+舒普深(3 g，q8h)静脉滴注，患者发热趋势较前下降，病情平稳后出院，门诊规律复诊。

1.2 病例2 患者女性，73岁，2021年10月15日因“反复腹痛半月余”入我院外科，既往有高血压、糖尿病病史。患者半月余前无明显诱因出现上腹部及脐周隐痛，无腹胀、腹泻、恶心、呕吐、发热及恶寒等，入院查体：肺部听诊呼吸音粗，双肺未闻及啰音，腹部无压痛及反跳痛，余查体阴性。实验室检查：血白细胞32.37×109/L，中性粒细胞百分比87.9%，CRP 89.6 mg/L，血清蛋白20.2 g/L，PCT 0.69 ng/mL，血肌酐118 μmol/L；24 h尿蛋白5.874 g，尿白细胞280.5个/μL。入院后患者出现发热，体温最高达38℃，我科会诊后诊断为NS并发感染，转入我科进一步治疗。10月26日转入后查胸部CT平扫提示双肺感染，双侧胸腔积液。NS并发感染可诊断，取浅部痰、尿、血行病原学培养以及肺炎支原体、抗CMV-IgM、CMV、呼吸道病毒、曲霉菌GM抗原等检测均为阴性，予舒普深经验性抗感染。31日患者突然出现高热、寒战，体温最高达39.9℃，呼吸气促，肢体颤动，意识障碍。查体：脑膜刺激征阳性，余病理征未引出。血气分析提示Ⅰ型呼衰，提示患者感染加重，抗感染方案调整为亚胺培南(1 g，qd)+利奈唑胺(600 mg，q12h)静脉滴注。完善支气管镜及腰椎穿刺，留取肺泡灌洗液及脑脊液行NGS检测。11月2日脑脊液NGS检测提示嗜麦芽窄食单胞菌。脑脊液常规：白细胞计数22×106/L，中性粒细胞67%，潘氏蛋白2+；脑脊液生化：氯离子142.9 mmol/L，蛋白1 212 mg/L，墨汁染色阴性。复查胸部CT提示：双肺感染较前吸收，双侧胸腔积液较前减少。影像学提示肺部感染较前好转，细菌性脑膜炎可诊断，考虑嗜麦芽窄食单胞菌对亚胺培南、美罗培南等碳青霉烯类抗生素天然耐药，停用亚胺培南及利奈唑胺，单用舒普深(1.5 g，q12h，静脉滴注)抗感染治疗，后患者体温渐恢复正常，肢体颤动消失，查体脑膜刺激征阴性，复查脑脊液白细胞正常，维持足疗程抗菌药物治疗后，患者病情稳定出院，门诊随诊。

2 讨论

隐球菌是最常见的机会性侵袭性真菌之一，由于自身免疫疾病、肾功能不全等易感人群增多以及糖皮质激素、免疫抑制剂等使用，隐球菌感染率呈上升趋势[5]。尤其免疫抑制患者对隐球菌感染的免疫反应更差，临床症状更隐蔽，传统检测阳性率偏低[6]。本文中病例1患者感染症状及影像学表现无特异性，取痰、血等标本行传统病原学检测均为阴性，行肺泡灌洗液NGS检测明确诊断为肺部隐球菌感染。患者神经系统方面仅存在双颞部、颈部疼痛症状，考虑隐球菌与中枢神经系统有高度亲和性，行脑脊液检测进一步诊断为隐球菌性脑膜炎。隐球菌性脑膜炎是一种极为凶险的中枢神经系统感染性疾病，即使积极治疗，病死率仍高达60%[7]。隐球菌抗原检测的灵敏度和特异度都较高，但是由于临床表现多样性及典型症状出现延迟性，从而导致隐球菌感染易漏诊。有研究[8]表明隐球菌感染漏诊率可达27%，且漏诊患者90天病死率显著升高。因此，临床工作中应加强重视免疫抑制患者隐球菌感染风险及多种病原学检测诊断技术的应用价值。

嗜麦芽窄食单胞菌是一种机会性病原体，以侵犯肺部最为常见，导致中枢神经系统感染相对少见[9]。目前对嗜麦芽窄食单胞菌脑膜炎的了解来源于世界各地散在病例报道，这些患者在感染之前往往有神经外科手术相关的病史[10]，目前尚无NS患者颅内感染嗜麦芽窄食单胞菌的报道。本文中病例2患者出现意识障碍等神经系统表现，脑脊液传统病原学检测阴性，感染致病菌不明，虽然积极给予经验性抗感染治疗，患者病情仍持续进展，甚至危及生命。后行脑脊液NGS检测明确诊断为嗜麦芽窄食单胞菌感染，经调整抗感染治疗方案后患者病情得到控制，并逐渐好转。

NGS是一种新兴的病原体检测方法，通过对标本中的所有微生物进行测序，能够同时识别细菌、真菌、病毒等多种致病病原体，避免传统病原检测效率低、时间长的缺点，对于混合性感染、疑难重症感染的检测具有重要作用[11]。Duan等[12]比较NGS和传统培养的诊断价值，发现NGS的灵敏度高于传统检测方法(67.4% VS 23.6%),差异有统计学意义(P<0.001)。中枢神经系统感染性疾病是神经系统重症疾病，具有高病死率和致残率等特点。因病原微生物检测手段有限，极易延误诊断及治疗[13]。NGS不需要假设潜在感染病原体类型，克服了PCR、培养、免疫标志物等靶向诊断方法的局限性，在检测新发、少见和诊断困难的病原体上呈现了巨大优势[14]。

NGS越来越多地应用于临床实践，但目前NGS检测的成本仍显著高于传统实验室检测方法，因此，对于NS并发轻症感染性疾病或传统微生物检测能够明确病原体的感染，尚不能作为一线检测手段[15]。二代测序的优势在于其能检测到其他传统手段无法检测到的病原体，对于传统病原学检测不能明确病原体、规范性经验抗感染无效的患者，推荐在完善常规病原学检测同时开展NGS。严重感染常存在病原体不明的情况，若感染危及生命，表现为脓毒性休克、血流感染、脑膜炎、严重肺炎等，除了传统检测方法，建议开展NGS尽快明确病原体[16-17]。研究[18]表明经验性抗感染不能完全覆盖病原体，使用NGS之后超过一半的患者需要进行抗菌药物调整或降级。因此，若传统病原学检测的结果不能完全解释临床表现的全貌或抗感染治疗的反应，怀疑同时存在其他病原体感染，在完善更多检测技术的同时，专家共识推荐进一步完善NGS检测[16]。

虽然检测准确性及时效性较传统病原微生物检测技术存在很大优势，但NGS技术作为新型的病原微生物检测技术，也面临许多挑战，包括价格昂贵，提供检验的机构多元而检测质量良莠不齐，无法对于检出的致病性病原微生物予以药敏结果指导等[19]。但是，随着测序成本的降低及技术的改进，相信NGS在感染性疾病的应用会有更光明的前景。

在NS的诊治过程中处理感染相关问题，是临床医生面临的一个挑战。本文报告NGS技术在2例NS并发感染患者中的成功应用，提示临床医生应关注新型病原检测技术在免疫低下人群中的应用，特别是对传统培养阴性的患者标本进行NGS检测，有助于早期诊断及治疗，对原发病的治疗及长期预后的改善，具有重要意义。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。