肝纤维化动物实验模型的研究进展

南 洋 董 辉 王志刚 刘树民

1.黑龙江中医药大学药学院，黑龙江哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学中医药研究院，黑龙江哈尔滨 150040

肝脏是由细胞与非细胞两部分组成的，肝纤维化是由多种外界因素刺激肝的非实质细胞所导致。致使肝库普弗细胞、肝窦状内皮细胞、成纤维细胞等分泌大量转化生长因子-β，其导致肝星状细胞（hepatocellular stellate cell，HSC）或肌成纤维细胞（myofibroblasts，MFB）活化，使细胞外基质（extracellular matrixc，ECM）异常堆积，最终导致肝纤维化[1-2]。活化的HSC 是肝纤维化发生的核心。肝脏在受到一定的损伤时可以进行自我修复，但是多次的损伤会使肝脏的病变不可逆，导致肝纤维化的产生，进一步会形成肝硬化甚至发展为肝癌[3]。各种动物模型被用于这一领域，许多学者致力于研究标准的肝纤维化模型，帮助肝纤维化的临床诊断和治疗纤维化药物的选择与评价。

1 肝纤维化的机制

肝纤维化是各种原因造成的慢性肝细胞反复损伤所致的肝功能和结构的病理改变，表现为ECM 的大量合成和分解的减少，引发ECM 成倍沉积，汇管区大量纤维组织增生异常。病毒侵袭、先天性代谢缺陷、化合物毒性、自身免疫性肝病等因素均可引起肝纤维化。HSC 的激活是肝纤维化发生的核心环节，HSC 主要作用是识别和降解大分子，分泌细胞因子、生长因子和激素等促进细胞之间的通信及肝脏再生的功能[4]。HSC 为肝的非实质性细胞，具有代谢和贮存维生素A 的作用，HSC被激活时转化为另一种促纤维化的细胞，即MFB[5]。

2 实验模型

疾病研究的基础是制备出与人类疾病的发生机制、发展过程相似的实验动物模型，并且具有可复制性、操作方便、经济实惠的特点。目前常用的肝纤维化模型造模方法有化学法、饮食法、手术和病毒感染。

2.1 化学方法造模

2.1.1 酒精 酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）通常以肝脏细胞脂肪堆积开始，逐渐进展为肝纤维化和肝硬化。过多的酒精摄入可导致活性氧产生、谷胱甘肽消耗、脂质过氧化和胶原合成增加[6]。这些机制诱导肝细胞凋亡、炎症和HSC 的活化。现代实验研究多采用小鼠急性酒精灌胃法，使肝细胞在短时间内出现炎症，引起肝纤维化病变，并将其控制在肝纤维化阶段。但ALD 模型主要涉及轻度肝损伤（即脂肪变性和轻中度炎症），与人类的严重ALD 存在差别[7]。为了克服这种问题，目前常采用慢性酒精法与急性酒精法结合应用，来模拟人类酒精肝纤维化的环境，但由于造模方法复杂、成功率低，应用并不广泛。

2.1.2 四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）CCl4对啮齿类动物具有广泛的肝脏毒性，是诱导肝纤维化模型中最常用的方法，在很多方面其与毒性损害有关的人类慢性疾病相似。细胞膜上的磷脂分子遭到CCl4的攻击，形成脂质过氧化过程，从而引起小叶中心肝细胞坏死、库普弗细胞活化和炎症反应诱导[8]。通过CCl4和3，5-二乙氧基羰基-1，4-二氢诱导肝细胞中的微RNA，导致肝细胞的损伤和再修复[9]。CCl4作用于HSC，使其激活，转化为MFB，MFB 增殖发展为肝纤维化，而MFB 在短时间内迅速地成倍堆积，严重时可发展为肝硬化，更进一步会进展为肝癌[10]。CCl4方法适用于大鼠和小鼠，采用此法应注意特别注射浓度和时间，因为CCl4毒性极高，容易引起肝硬化、急性毒性死亡。此方法的优点在于价格低廉、可靠性强和可重复性较高，是目前应用最为广泛的造模方法。

2.1.3 硫代乙酰胺（thioacetamide，TAA）与CCl4类似，TAA 是一种肝毒性物质，经细胞色素P450 活化，产生硫代乙酰胺二氧化硫。其引发肝毒性的作用机制尚不明确，可能是其与脂肪酸、氨基酸发生反应，而引起毒性[11]。进而造成脂质成分过氧化，破坏细胞膜的通透性，导致肝小叶中心死亡，故而诱导HSC 细胞活化，产生肝纤维化。此方法对大鼠更加敏感，但也可以用于小鼠。最近该大鼠模型已标准化，给药3 次/周，150 mg/（kg·次），为期8～12 周。口服给药建模时间将更长一些，当口服浓度为300 mg/L 时，C57BL/6小鼠需要2～4 个月才能发生显著肝纤维化[12-13]。TAA 模型是常用的肝纤维化模型，主要用于抗纤维化药物的评价。

2.1.4 二甲基亚硝胺和二乙基亚硝胺（dimethylnitrosamine/diethylnitrosamine，DMN/DEN）DMN/DEN 均属N-亚硝基化合物，具有强烈的毒性，主要依靠细胞色素P450 代谢激活，转变为更具活性的代谢产物，通过激活DNA 片段、产生活性氧和促进金属蛋白酶活化等多种方式，引发肝小叶中心坏死，产生肝细胞癌变[14]。肝组织出现血清总胆红素显著升高、肝门脉窦性狭窄、肝门周围血管扩张、肝假小叶形成和炎症细胞浸润等，还有部分可见明显的胶原纤维增生等现象[15]。Ding 等[16]利用大鼠建立了全面的肝炎-肝纤维化-肝癌模型，为肝病发展的不同阶段模型建立提供了参考。此研究显示，注射DEN（30 mg/kg）2 次/周，8～12 周病理学可观察到肝脏进入到肝纤维化阶段。或用1%的DMN 溶液（1 ml/kg），腹腔注射1 次/d，3 d/周，连续4 周[17-18]，也可以形成肝纤维化。

2.2 饮食方法造模

2.2.1 蛋氨酸和胆碱缺乏（methionine and choline deficient，MCD）饲料 目前常用MCD 饲料构建研究非酒精性脂肪性肝炎模型。该模型的特点是脂肪酸从脂肪组织流向肝脏和增加甘油三酯，库普弗细胞可能在MCD 饲料诱导的肝脂肪变性的起始和进展中发挥作用，因为其是肝细胞损伤的第一个应答者[19]。巨噬细胞的浸润还可以促进促炎症通路和介质的上调，HSC 细胞被激活将引导病理进入纤维化的阶段。研究中发现，NOD 样受体蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）炎症小体激活后，使用NLRP3 选择性抑制剂可以显著减缓肝纤维化进展[20]。喂食MCD 饲料的小鼠在8 周后出现脂肪性肝炎[21]，而肝纤维化的阶段需要更长时间的喂养才可观察到[22]。然而这种饮食模式构建的动物模型缺乏一些人类患者的主要病理特征，如无血清胰岛素、空腹血糖、瘦素和甘油三酯等水平降低。目前常采用复合造模的方式以改善上述不足，在MCD 饲料的基础上结合基因修饰小鼠，能更好地模拟人类肝纤维化特点[23]。

2.2.2 高脂类饲料 非酒精性脂肪性肝炎主要是由于过量食用高脂肪类成分而引起的，患者吸收营养过多而缺乏基本运用，从而导致肝细胞内脂肪过度积累形成肝纤维化。高脂肪饲料克服了MCD 饲料的缺点，因为动物体重增加和外周胰岛素抵抗发展，该模型通过复制不良生活习惯来模拟疾病的病因，具有与人类非酒精性脂肪性肝炎相似的表型特征。但在小鼠中需要52 周才能发展为仅伴有轻度纤维化的脂肪性肝炎[24]。雄性近交C57BL/6 小鼠是最适合使用高脂肪饮食发生非酒精性脂肪性肝炎的啮齿动物，但这种饮食模式的主要缺点是缺乏肥胖和胰岛素抵抗。此种造模方式操作简单，可重复性强，能表现出与类似于人体内肝脏的内环境病变。这种模型适用于高脂类肝纤维化的病理机制和用药筛选。

2.3 手术方法造模

胆总管结扎可造成胆汁淤积损伤和门静脉周围胆道纤维化，其是由两个结扎之间横切的双结扎胆管组成[25]。术后7～10 d，胆管狭窄，胆管压力升高，胆管上游扩张，造成肝体积增大，胆管增生[26]。有研究发现，除了HSC 在纤维形成中的相关作用外，门静脉纤维化可能是活跃的门静脉成纤维细胞产生的。后者可能通过白细胞介素-13 激活造血干细胞形成该模型中的MFB[27]。一般来说，胆总管结扎后，由于胆漏、胆囊炎或胆囊破裂，可能导致实验动物死亡率高，所以适用于短期研究，难以广泛推广。

2.4 遗传修饰小鼠模型

2.4.1 foz/foz 小鼠 foz/foz 小鼠具有一个突变的Alms1 基因，采用高脂饲料继续喂养，foz/foz 小鼠会出现脂肪限制，促进脂质流向肝脏和血清脂联素水平下降，胆固醇水平升高，导致脂肪炎症、肝细胞损伤，继而向更严重的纤维化发展[20]。该模型依赖于饮食和基因修饰的相互作用，从而促进肝损伤。因此，实验表明，喂食高脂饲料时，这些动物表现出过度肥胖、胰岛素抵抗和严重的肝炎，还会伴有明显的肝纤维化[28]。

2.4.2 db/db、ob/ob 小鼠 db/db 小鼠是瘦素受体点突变导致瘦素信号通路障碍，致小鼠出现肥胖、胰岛素抵抗、高血糖、脂肪肝等症状。db/db 小鼠高脂肪喂养5 周后，出现明显的肥胖和脂肪性病变。其白色脂肪组织的特征是氧化应激相关基因表达增加、巨噬细胞浸润、脂联素减少和脂质代谢受损[29]。db/db 和ob/ob 小鼠的优势是其表型在很多方面都能模拟人类代谢综合征，缺点在于它们不会自发形成非酒精性脂肪性肝炎和肝纤维化。

2.5 基于感染的模型

由于与人类感染的高度相似和高重现性，血吸虫病是一种具有传染性的寄生虫感染疾病，由血吸虫尾蚴感染宿主，引起肝细胞的损伤的人与动物共患疾病[30]。虫卵在肝脏沉积，刺激体内的免疫反应激活HSC，使HSC 迅速积累，造成炎性肉芽肿，其外围由MFB 和胶原纤维过度沉积的纤维围绕，最终形成肝纤维化[31]。孔庆明等[32]运用小鼠感染血吸虫尾蚴建立肝纤维化动物模型，应用HE 染色和Masson 染色评估肝脏纤维化，显示16 周后模型建立成功。但需要注意的是血吸虫是人与动物均可感染的，所以对实验室操作要求较高，保证操作研究者的自身安全。

3 小结与展望

肝纤维化是肝损伤后持续愈合的结果，该病的进展通常与肝炎病毒感染、酗酒和非酒精性脂肪性肝病有关。迄今为止唯一可用的治疗方法是肝移植，然而受到治疗费用高和肝捐赠者数量有限的阻碍，因此迫切需要找到临床治疗有效的方法。建立可靠稳定的动物模型对研究人类肝纤维化有着极大的帮助，能够帮助研究人员进行肝纤维化的机制和抗纤维化新药的开发研究。优秀的动物模型应该能最大限度地重现疾病发展的过程，同时应具有良好的可重复性和稳定性。综上所述，现阶段的动物模型可以模拟不同病因所引起肝纤维化，但还不能完全代替人体用来进行疾病的发展和治疗研究。随着不断深入的研究探索，将会建立出能够模拟整个病程病机和药物筛选的优秀动物模型。